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1、亚油酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒固定化菠萝蛋白酶的研究* 本课题为山东省优秀中青年科学家科研奖励基金资助（200603044）。通讯作者：刘晨光 副教授 传真：86+532+82932586。 E-mail: 。 第一作者：谭玉龙 硕士研究生。收稿日期：2007年月日。谭玉龙，刘晨光，刘成圣，于乐军（中国海洋大学 海洋生命学院，青岛266003）酶的固定化技术有很多优点，它可以显著提高酶的活力和稳定性，使酶可以在极端的pH和温度下进行反应。不同的剂型已应用于酶的固定化，比如薄膜（Tanioka et al. 1998, Arica 2000），微球（Wu et al. 2005），纳米粒（Akiy
2、oshi et al. 1998, Li et al. 2003, Tang et al. 2007）等。最近，纳米材料因为其特别的性质与广泛的应用已越来越多地引起人们的关注，纳米胶束和纳米粒已被用于固定化酶。由聚乙二醇-聚天冬氨酸嵌段共聚物制备的纳米胶束可用来包埋酶分子（溶菌酶、胰蛋白酶）（Harada et al., 1998, 2001, Yuan et al. 2005）。Sunamoto的研究小组（Akiyoshi et al. 1998）曾合成了普鲁兰糖的胆甾烯基衍生物，可在水中自聚集成凝胶纳米粒，并可与胰岛素等药物形成稳定的复合物。在以往的研究中发现胰蛋白酶可负载于纳米粒上（Li
3、u et al. 2005），这与氯键疏水作用力以及离子相互作用有关。但固定化酶的性质（比如稳定性、动力学常数等）还需要进一步研究。本文作者采用亚油酸修饰羧甲基壳聚糖，通过超声的方法制备凝胶纳米粒。选择菠萝蛋白酶应用于实验因为其在动物炎症及人类炎性肠病等方面都有积极的治疗作用。酪蛋白作为酶解反应的底物。将菠萝蛋白酶固定于纳米粒上。探讨了影响固定化酶活力的因素（包括温度、储存稳定性等）。结果表明，酶被固定化后，热稳定性及储存稳定性均有提高。固定化酶的Km值小于自由酶，表明固定化可以提高酶的稳定性并加强酶与底物的亲和力。一、材料及方法1. 化学试剂壳聚糖（低分子量），亚油酸（LA），1乙基3（3二
4、甲基氨丙基）碳二亚胺（EDC），菠萝蛋白酶均购于Sigma公司。其他试剂都采用分析纯。2. 制备方法（1）制备羧甲基壳聚糖（CMCS）Na型羧甲基壳聚糖的制备：称取5g壳聚糖于三口烧瓶中，加入100ml水/异丙醇（v/v=1/1），搅拌，使其溶胀。加入6.75g NaOH，50搅拌1h。让壳聚糖在碱性条件下膨胀, 形成碱化中心。将7.5g氯乙酸溶于10ml异丙醇，溶解后加到分液漏斗，向三口烧瓶中滴加，控制滴加时间30min, 50搅拌4h。反应结束后，布氏漏斗抽滤，70%、80%、90%乙醇水溶液、无水乙醇洗涤。所得产品放入60烘箱烘干, 即得白色粉状羧甲基壳聚糖（Na型）。H型羧甲基壳聚糖的
5、制备：称取2.5g Na型羧甲基壳聚糖，加入100ml 80%乙醇水溶液，搅拌。再加入10ml 37% HCl溶液，搅拌30min。布氏漏斗抽滤，70%、80%、90%乙醇水溶液、无水乙醇洗涤。所得产品放入60烘箱烘干,即得白色粉状羧甲基壳聚糖（H型）。（2）制备亚油酸羧甲基壳聚糖（LA-CMCS）首先取1g羧甲基壳聚糖溶解于100ml 1%的醋酸溶液(pH4.6)中，然后分别取1ml、1.5ml、2ml亚油酸溶于100ml甲醇中。将两溶液混合，加1mlEDC，搅拌24h后，加入200ml甲醇/氨水（体积比为7：3），搅拌，5000rpm/s，离心30min，去除上清。将沉淀分别用甲醇洗两次，
6、乙醚洗一次，每次洗涤后都要进行5000rpm/s，离心30min，去除上清。室温真空干燥24h。（3）制备负载菠萝蛋白酶的LA-CMCS纳米粒10mg LA-CMCS悬浮于10ml PBS缓冲液(pH7.4)。冰浴中用探头超声(Utralsonic homogenizer UH-600)，超声重复两次得到澄清透明溶液(20W，工作10S，停2s)。加入不同浓度的菠萝蛋白酶溶液，然后再分别超声两次。（4）载药量和包封率将不同浓度的菠萝蛋白酶溶液加到1ml 0.2mg/ml的纳米粒溶液中，浓度从0.05mg/ml到0.4mg/ml。将混合液超声，然后超滤，得到固定化酶。通过检测未固定化的酶含量来计
7、算纳米粒对酶的的负载量与包封率。载药量=（A-B）/C100包封率=（A-B）/A100A为加入的菠萝蛋白酶含量；B为超滤后未固定化的菠萝蛋白酶含量；C为冷冻干燥后的纳米粒质量。（5）测定自由酶和固定化酶的酶活力取2ml酶液加入试管中,然后加入1%的酪蛋白溶液3ml,准确保温37反应10min,再加入5ml三氯乙酸以终止反应, 摇匀。空白试样,方法同上,仅在加酪蛋白溶液之前,先加入5ml三氯乙酸使酶失活,再加入酪蛋白溶液。以空白样做对照,用分光光度计280nm波长测定试样的吸光度(O.D)。结果取三次测定的平均值。（6）菠萝蛋白酶活力单位将一个酶活力单位在标准实验条件下 (pH7.4，37时，
8、反应10min），1min内水解酪蛋白产生1mg溶于三氯乙酸的酪氨酸时所需要的酶量。二、结果与讨论1. 纳米粒表征亚油酸通过EDC共价连接于羧甲基壳聚糖的氨基上（图1）。红外谱图及核磁共振谱图表明，共价连接成功。平均粒径与粒径分布通过动态激光光散射仪来分析，平均粒径约为417.8 17.8 nm (Liu et al. 2007)。透射电子显微镜照片显示纳米粒有完整的圆形结构（图2）。2. 纳米粒的载药量与包封率纳米粒对菠萝蛋白酶的负载量与包封率如表1所示，一方面，随加入酶的浓度的增加，从0.05到0.3mg/ml，纳米粒的包封率逐渐下降；另一方面，酶的负载量却从20.680.37%增加到 9
9、4.191.12%。但是，当浓度到达0.4mg/ml时，负载量却没有显著增加，表明纳米粒负载菠萝蛋白酶约0.3mg/ml时达到饱和。3. 温度对酶活力的影响在2080下测定自由酶与固定化酶的活力（图3），其最适温度相同，固定化酶的最适温度（60）也未改变。热稳定性是固定化酶的一个重要指标，将固定化酶和自由酶保存于0.05mol/L的PBS缓冲图1亚油酸羧甲基壳聚糖的结构图表1载药量和包封率菠萝蛋白酶 (mg/ml) 包封率 (%) 载药量 (%)0.05 82.721.47 20.680.370.1 71.571.32 35.790.660.2 64.831.69 64.831.690.3 6
10、2.790.75 94.191.120.4 49.280.49 98.550.98图2纳米粒的透射电镜照片液(pH7.4)中，在不同温度下保存1h，迅速冷却测其酶活力。在不同温度下保存后的相对酶活力，随着温度升高，相对酶活力均有所下降（图4）。从图中看出固定化酶的热失活曲线比自由酶要低。在90保存1h后，固定化酶保持了19%的相对活力，而自由酶在同样的实验条件下，几乎丧失了全部活力。固定化酶热稳定性的提高是因为酶和纳米粒之间的多重的作用（比如离子相互作用、氢键结合以及疏水作用力等）。有一部分菠萝蛋白酶被包裹于纳米粒内部，这可以保护酶的结构使其免受高温的破坏。纳米粒可以预防蛋白质不可逆的变性聚集
11、，其机制类似于分子伴侣的作用(Akiyoshi et al. 1999, Takehiro et al. 1994, Nomura et al. 2003) 。不论是从结构上还是从酶活力上，纳米粒均可显著提高酶分子抵御变性的能力和热稳定性，所以其可作为有效的酶固定化材料(Bryjak et al., 1998, Hsieh et al. 2000, Karim et al., 2002, Li et al. 2003, Wu et al. 2005, Tu et al. 2006) 。图3 温度对酶活力的影响图4 自由酶和固定化酶的热稳定性4. 储存稳定性在无底物存在的情况下，将固定酶和自由酶
12、在70下分别保存20 min120 min, 迅速冷却后, 测其活力(图5)，固定化酶的稳定性曲线比自由酶要高，表明固定化酶的稳定性有显著地提高。5. Km米氏常数Km是酶的一个重要参数，它的物理意义就是催化反应速度达到最大速度一半时的底物浓度。Km一般用来检验酶与底物形成复合物的亲和能力。自由酶和固定化酶的米氏常数的测定(图6),纳米粒固定酶后，对酶与底物之间的结合影响很小。固定化酶的Km为0.36，比自由酶的0.68略低，表明固定化酶加强了酶与底物的亲和力。原因可能是固定化过程对酶的构象有影响，以及纳米粒与酪蛋白之间的电荷作用或疏水作用也加强了酶对底物的亲和力。其机制还需要进一步研究。这一
13、结果也与Tang等(2007)的研究结果一致，这使其在将来的应用性上更有吸引力 (Tang et al. 2007) 。图5 自由酶和固定化酶的储存稳定性图6 自由酶和固定化酶的Line-weaver Burk 曲线参 考 文 献Akiyoshi, K. , Kobayashi, S. , Shichibe, S. , et al.1998. Self-assembled hydrogel nanoparticle of cholesterol-bearing pullulan as a carrier of protein drugs: Complexation and stabilizat
14、ion of insulin, J. Control. Release, 54: 313320 Akiyoshi, K. , Sasaki, Y. , Sunamoto, J. . 1999. Molecular chaperone-like activity of hydrogel nanoparticles of hydrophobized pullulan: thermal stabilization with refolding of carbonic anhydrase B, Bioconjugate Chem. , 10: 321324Arica, M. Y. . 2000. Ep
15、oxy-derived pHEMA membrane for use bioactive macromolecules immobilization: Covalently bound urease in a continuous model system, J. Appl. Polym. Sci. , 77:20002008Bryjak, J. , Kolarz, B. N. 1998. Immobilization of trypsin on acrylic copolymers, Process Biochem. , 33: 409417Harada, A. , Kataoka, K. 1998. Novel polyion complex micelles
