番茄植株中的青枯菌的分布特点

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1、1、大田图片2、发生严重度分级图片3、弱化指数图片4、青枯菌真伪图片番茄大田青枯雷尔氏菌分布特性的研究周游1,2，郑雪芳2,刘波2 ,朱育菁2,车建美2,张文州1,2(1.福建师范大学生命科学学院，福建福州350008; 2.福建省农业科学院农业生物资源研究所，福建福州350003)摘要：调查了福建省福鼎市番茄青枯病的发生特点。番茄植株上分离的菌株，应用形态学鉴定和分子鉴定相结合 的方法，从番茄的青枯病植株中共分离到36种形态上类似青枯雷尔氏菌的菌株，经过分子鉴定一共筛选到27株青 枯雷尔氏菌，并且包含4株弱致病力的青枯雷尔氏菌。总体来看，在植株的不同发病的时期，植株体内的青枯雷尔 氏菌的分布

2、也是不同的，健康植株在茎基部和茎上部分离到青枯雷尔氏菌，并且可以分离到弱致病力的菌株。发病1 级的植株，在其根部和茎基部分离到青枯菌，在分离的青枯菌中发现有弱致病力菌株的存在。发病2级的植株，青 枯菌分布在茎基部和茎上部，青枯菌均为强致病力的菌株。发病3级的植株，只在茎上部分离到青枯菌，并且这些 青枯菌均为强致病力的菌株。总体分析：在植株发病的不同时期，植株体内的不同部位的菌含量也是不同的，它们 之间也是存在差异的。如果在植株体内分离到弱菌株，则此植株的发病等级较低。关键词：番茄青枯病；病原菌鉴定；分布特点Identification and Distribution Analysis of

3、Bacterial Wilt Pathogens fromTomatoZhou You1，2, Zheng Xuefang2, Liu Bo2基金项目：国家自然科学基金(30871667)；国家“863”计划项目(2012AA101504)；福建省自然科学基金项目(2009J01087)；福建省财 政专项-福建省农业科学院科技创新团队建设基金(N o.STIF-Y03)作者简介：周游 通讯作者(责任作者)， E -mail： , Zhu Yujing2, Che Jianmei2, Zhang Wenzhou1，2(1College Of Life Science Fujian normal

4、university, Fuzhou 350108, China;2Biotechnology Institution, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003)Abstract:Key words: tomato bacterial wilt, pathogen identification, distribution(前言请从研究目的意义、前人研究进展、本研究切入点、拟解决关键问题几个方面着手写) 由Ralstonia solanacearu引起的植物细菌性青枯病是一类世界范围的毁灭性土传病害，在热 带和亚热带地区发生普

5、遍，为害严重1。青枯菌寄主范围广泛，可侵染54个科的450余种植物2。该 病除危害番茄外，还危害茄子、辣椒、花生、生姜等作物。番茄感染青枯病后，一般成株期发病，先是顶叶萎蔫下垂，然后下部叶片凋萎，最后中部叶片 凋萎，也有一侧叶片先萎蔫或全株叶片同时萎蔫。给农业生产造成极大的经济损失。植株死亡后 叶片仍保持青绿色。本研究旨在通过采样、病原菌分离鉴定及致病性检测，旨在了解青枯病菌在 植株不同发病时期的分布情况，为病害的防治提供依据。目前对植物青枯病的防治尚未有理想的药剂，抗病品种的应用也受到地区间的限制以及品种抗 性丧失等问题的困扰7,8，使得该病害的防治一直是一大难题。对植物青枯病进行生物防治是

6、比较理 想的方法，青枯病生物防治十余年来受到国内外研究者广泛关注。我们利用青枯雷尔氏菌的无致病力菌株处理植株，经过侵入、定殖，在植株体内形成营养竞争, 构建植株体内微生态平衡，从而阻碍病原菌的侵入、抑制病害发生。利用植物内生细菌防治植物病 害，特别是土传及维管束病害具有独特的作用效果，已被认为是植物病害，尤其是化学防治较为困 难的植物病害生物防治的天然资源菌I02。1.材料与方法11番茄青枯病田间病情调査2011年12月，调查福建省福鼎市（具体地点）的番茄青枯病发生情况与症状，调查内容？调 查方法？并采集病株进行病原菌的分离鉴定。在福鼎市采集大棚成株期的发病级别0级、1级、2级 和3级番茄植株

7、。发病率及病情指数调查参照方中达植病研究方法的相关内容13。番茄青枯病按发病严重程 度分为5级，O级为叶片无症状；1级为植株1/4以下的叶片表现萎蔫症状：2级为植株1/4-1/2叶片 表现萎蔫症状：3级为植株1/2以上叶片表现萎蔫症状：4级为全株萎蔫死亡。1.2番茄青枯雷尔氏菌的分离培养（分离方法简化，请参考相关文献）植株预处理：植株先用清水清洗，用报纸将植株水分吸干。称样及样品处理：称取根、茎基部、茎中部、茎顶部、叶各1 g,先用75%酒精消毒30s再用 10%的NaCLO消毒5min,然后用无菌水清洗3遍，再用灭菌滤纸将样品吸干，放至装有10 mL无 菌水的研钵，充分研磨，即配成10-1浓

8、度；稀释样品原液：吸取1 mL原液至装有9 mL无菌水的试管，即配成10-2浓度，依次稀释配置成 10-3。平板涂布：超净台上无菌操作，溶液在振荡器上振荡10-20 s,吸取200此至相应标记浓度的平 板上，溶液滴至平板中央，用涂布棒涂匀。涂好的平板正放静置一会，使溶液渗透进平板中。每个 梯度重复3次；培养:：将涂好的平板用袋子装好倒置于30C恒温箱中培养60h；划线分离纯化：观察分离培养的菌落，将要纯化的菌落标上标记，无菌操作用接种环直接取平 板上要分离纯化的菌落至相应标记的平板上，划线完后放在30C温箱中培养.；发病植株周围土壤的分离，取10g 土放在90mL的水中，用无菌水依次稀释到10

9、-2、10-3。各取 100uL稀释液涂布于TTC培养基上进行内生细菌的分离，试验重复3次。根据菌落形态、颜色、边缘 状态、透明度、表面干湿状态等特征判断分离出的菌落种类并计数。按常规方法挑取单菌落纯化后 保存，供测试鉴定。1.3致病性测定选5-6叶龄的番茄盆栽苗为接种对象。用分离纯化的菌株的菌悬液（108Cfu/mL）进行伤根接种， 设3个重复，以无菌水为对照。按种后的番茄盆栽苗放置相对湿对100%，温度30 C的光照培养箱中 培养。期间进行正常的栽培管理，定时观察植株的发病情况。对接种后发病植株重新进行组织分离 培养。1.4病原菌的形态鉴定观察青枯雷尔氏菌在TTC培养基上生长的菌落形态（大

10、小、颜色、干湿度等）在显微镜下观察 青枯雷尔氏菌菌体形态特征。1.5病原菌的分子检测从不同病情等级的番茄植株和接种后回收的番茄病株分离的青枯病原菌采用水煮法提取 DNAi8。采用青枯雷尔氏菌特异性引物pehA#6和pehA#3进行青枯雷尔氏菌的分子检测，引物设计参 见文献19, 引物序列 pehA#6 : 5-ATCGGACTTGATGCGCAGGCCGTT-3 , pehA#3 : 5-CAGCAGAACCCGCGCCTGATCCAG-3,。PCR 反应程序为：96C预变性 1 min； 96C 变性 30S, 70C 退火30s, 72C复性1 min ,重复2个循环；94 C变性30s、

11、70C退火30s、72C复性1 min,重复33 个循环；最后72C下延伸5min。PCR产物的检测：取10pL PCR产物，点样于1.5%的琼脂糖凝胶中, 以100bp Marker作为标准分子量，120V电压、1倍TAE缓冲液中电泳2h, EB染色，采用凝胶成像系 统观察结果。1.5病原菌在番茄植株体内的分布统计统计不同生育期、不同发病等级番茄植株不同部位青枯病原菌的分布数量，结合DPS数据统计 分析软件，分析番茄青枯雷尔氏菌在植株体内的分布特性。2结果与分析2.1番茄青枯病田间病情分析（列出表格，分析番茄种植大棚中不同等级青枯病发病率、不同生育期番茄植株青枯病的发病情况）茄青枯病植株，一

12、般成株期发病，先是顶叶萎蔫下垂，然后下部叶片凋萎，最后中部叶片凋萎, 也有一侧叶片先萎蔫或全株叶片同时萎蔫。此次调查3个大棚的青枯病的发病情况，这三个大棚的青枯病的发病率分别是1.5%, 2.2%, 8.2%。 2.3番茄青枯雷尔氏菌分离与致病性鉴定通过组织分离，在TTC培养基上，苗期不同等级的番茄植株共分离到？株菌，其中0级植株 分离到？株，菌株名称、，1级植株分离到？株，菌株名称、，2级植株分离到？株， 菌株名称、，3级植株分离到？株，菌株名称、，4级植株分离到？株，菌株名称、，。 开花期番茄植株共分离到？株菌，菌株名称、。将分离到的菌株进行致病性测定。经接种番茄 盆栽苗试验，？菌表现出青

13、枯病病症（图？ ？）。列表各菌株接种后番茄植株发病率、发病时间，判断菌株的致病力。2.2番茄青枯雷尔氏菌的形态特征描述经致病性鉴定致病性青枯雷尔氏菌在TTC平板上菌落特征为：流动性强，中间为粉红色，并且 白边比较宽，表面比较湿润（图）；经致病性鉴定的弱致病性或无致病性的青枯菌在TTC平板上菌 落特征为：无流动性，中间为暗红色，并且白边比较窄，表面比较干燥（图）在显微镜下，菌体形 态特征为：、（图）不同致病力青枯病菌存在形态差异，以弱化指数为指标，分析菌株的弱化指数与致病力相关性。 试验结果见表2。在番茄植株分离的菌株中，4株在形态学鉴定上是弱致病力的青枯菌，经体式显微 镜测量，他们的弱化指数分

14、别是0.734, 0.662, 0.643, 0.637。结合致病性鉴定结果，可以看出，弱 化指数大于0.637的均为致病力弱的菌株，菌株的弱化指数弱小于0.637,这样的菌株则为强致病力的 青枯雷尔氏菌。表2分离到的青枯雷尔氏菌的弱化指数菌株编号1弱化指数（平行测量）23弱化指数平均值10.6750.6450.6660.66220.5760.5680.5840.57630.5260.5120.5390.52640.5660.5570.6030.57550.7290.7410.7320.73460.5210.4980.5400.52070.5380.5360.5420.53980.5150.5

15、000.5300.51590.4700.4500.4750.465100.6370.6120.6570.635110.5360.5100.5570.534120.5270.5340.5140.525130.4570.4370.4620.452140.6600.5800.6700.637150.5340.5130.5450.531160.6410.6310.6580.643170.6200.6130.6320.622180.4360.4230.4470.435190.6110.6090.6170.612200.5160.4960.5340.515210.4570.4230.4670.4492.3番茄青枯雷尔氏菌的分子检测利用特异性引物PCR法将番茄植株中分离到的形态学上类似青枯雷尔氏菌的菌株进行分子检 测，经PCR扩增后，能扩增出特异性条带