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1、限制酶的多种切割方法以及在高中生物试题中的体现周荷静（相城区陆慕高级中学 215131）摘要： 本文总结了限制酶的多种割切方法，并分析其优缺点，并结合相关生物试题，对其更加深入理解。关键字：限制酶 单酶切 双酶切 高考题限制酶是基因工程中的工具酶之一，为了让目的基因能连接到运载体上，需要用限制酶分别切割含目的基因的DNA片段和运载体，切割方法有多种，现就其切割方法进行总结，分析其优缺点。近几年高考生物试题中几乎年年涉及到限制酶的切割方法，这应该引起教师的注意。1 单酶切1.1 同一种限制酶分别切割目的基因与运载体这是最简单的一种方法，用同一种酶切割后能产生相同的粘性末端，末端之间能发生碱基互补
2、配对而形成重组DNA分子。1.2 用同裂酶分别切割目的基因与运载体同裂酶：有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，这些有相同切点的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。 同裂酶差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如Hpa和Msp的识别顺序都是 5G|CGG3 和 3GGC|G5，如果其中有5-甲基胞嘧啶，则只有Hpa能够切割。例1 （2009年江苏生物高考题）苏云金杆菌(Bt)能产生具有杀虫能力的毒素蛋白。下图是转Bt毒素蛋白基因植物的培育过程示意图ampr为抗氨苄青霉素基因)，据图回答下列问题。(2) 图中表示HindIII与Bam
3、 I酶切、DNA连接酶连接的过程，此过程可获得_种重组质粒；如果换用Bst I与BamH I酶切，目的基因与质粒连接后可获得_种重组质粒。解析 题中考查的是相同的粘性末端才能发生碱基互补配对而连接这一知识点。用HindIII与Bam I酶切，则质粒产生两个粘性末端，分别是H和B，也就是说能与质粒连接的DNA分子的粘性末端也只能是H和B，用HindIII与Bam I酶切含目的基因的DNA片段，可得到4种DNA片段，他们的粘性末端分别是B、B和H、H和B、B，因此有中间的两个DNA片段可以与质粒连接，形成2种重组质粒。如果换用Bst I与BamH I酶切，属于同裂酶，产生相同的粘性末端，切割后的质
4、粒两侧的粘性末端都是B，用Bst I与BamH I酶切含目的基因的DNA片段，可得到3种DNA片段，他们的粘性末端分别是B、B和B、B,因此只有中间的DNA片段才能与质粒连接，形成1种重组质粒。1.3 用同尾酶分别切割目的基因与运载体有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶。同尾酶的切割产物可以通过DNA连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏。 例2 （2005年天津理综）限制性内切酶的识别序列和切点是GGATCC，限制性内切酶的识别序列和切点是GATC。在质粒上有酶的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶的切点。请画出质粒被限制酶切割后所形成的黏性
5、末端。请画出目的基因两侧被限制酶切割后所形成的黏性末端。在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接？为什么？解析 这两种酶属于同尾酶，能产生相同的粘性末端，因此能够连接起来。由于两者产生的粘性末端相同，因此粘性末端之间能发生碱基互补配对而连接。例3 （2010年江苏生物奥赛初赛）限制酶Sal识别的序列是GTCGAC，酶切后在5侧产生4个碱基突出，限制酶Xho识别的序列是CTCGAG，酶切后也在5侧产生4个碱基突出。如果将Sal酶切后的插入片段与Xho酶切过的质粒载体混合，在进行连接反应，那么产生的连接产物所具有的性质是：A使用Xho或Sal处理，插入物都会释放出来B
6、Sal处理可以使插入物释放出来，但Xho不行CXho处理可以使插入物释放出来，但Sal不行D无论使用Sal或Xho处理，插入物都不会释放出来解析 此处用同尾酶切割，能产生相同的粘性末端TCGA，因此能连接，但重组后的序列是CTCGAC 因此没有上述两种酶的切割位点。GAGCTG，1.3 单酶切的优点与缺点优点是操作简单。但它的缺点主要有两个：用单酶切切割后的目的基因两侧各有一个粘性末端，而且是相同的末端，因此这两个末端会发生碱基互补配对而使目的基因首位相连，形成自身连接体，成环状；同样的道理，切割后的质粒在DNA连接酶的作用下也会首尾连接，又恢复成没有切割前的样子。容易形成2种重组DNA分子，
7、其中一种重组DNA分子是我们所需要的，这样就加大了筛选工作量（图解形成2种重组质粒：其中B表示某种限制酶切割后产生的粘性末端)割后产生的粘性末端)+BBBBBBDNA连接酶BB注：箭头方向表示原目的基因表达的方向 BB BDNA连接酶BB+BBB 注:第一种情况下获得的重组质粒目的基因表达的方向与原目的基因表达方向一致,都能产生目的蛋白.第二种情况下将目的基因翻转180度,构建的重组质粒中目的基因表达的方向与原目的基因表达方向恰好相反,则不会产生我们需要的目的蛋白。由此可见，将同一种限制酶切割目的基因与质粒可以获得2种重组质粒，不能使质粒与目的基因发生定向连接。2 双酶切2.1 用两种限制酶分
8、别同时切割含目的基因的DNA片段和质粒例4 （2009福建理综）转基因抗病香蕉的培育过程如图所示。质粒上有Pst、Sma、EcoR、Apa等四种限制酶切割位点。请回答：（1）构建含抗病基因的表达载体A时，应选用限制酶 ，对 进行切割。 解析题中在抗病基因的两侧分别是Pst和EcoR的酶切位点，因此只能用这两种酶去切割，目的基因两侧的粘性末端是P和E，为了让目的基因与运载体结合，运载体两侧的粘性末端也只能是P和E，因此也只能用Pst和EcoR酶去切割质粒。2.2 双酶切的优点与缺点双酶切可以克服单酶切的两大缺点，由于目的基因与运载体的两侧的粘性末端不相同，因此可以防止目的基因与质粒自身连接体的发
9、生；同时只能产生1种重组质粒（图解只能形成1种重组质粒：限制酶A产生的粘性末端用A表示，限制酶B产生的粘性末端用B表示)BAABABDNA连接酶+BA不能连接BA+BA注：双酶切只能产生1种重组质粒，如果把目的基因翻转180度，则由于粘性末端不同，则不能发生碱基互补配对而连接。例5 （2008海南高考题）图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tctR为四环素抗性基因，P为启动因子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。（1）将含有目的基因的DNA与质粒表
10、达载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有 、 、 三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行 。（2）用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞接种到含四环的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是 。（3）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是 ，其合成的产物是 。（4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶时 。解析 本题是对单酶切和双酶切优缺点的考查（具体对应关系不做详述）。参考答案（1）目的基因载体连接物 载体-载体连接物 目的基因-目的基因连接物 分离纯化 （2）载体-载体连接物；目的基因-载体连接物、载体-载体连接物（3）启动子 mRNA （4）EcoRI和BamHI 双酶切的缺点是要用两种酶切割，由于每种限制酶作用的条件不同，一般不能两种酶不能同时使用，而是用完一种就要更换作用的外界条件，以保证酶的高效性。因此双酶切操作较复杂。
