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1、实验九 植物遗传转化农杆菌介导法一、目的 了解农杆菌转化的机理；掌握农杆菌介导转化水稻的技术二、原理根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)具有跨界转移DNA的能力。下列因子与转化过程有关：1. Ti 质粒 (tumor-inducing plasmid)上的T-DNA (transferred DNA) T-DNA是农杆菌Ti质粒上能够转移到植物基因组的一段DNA序列。T-DNA含有RB和 LB两个边界，它们是25bp的正向重复序列，是T-DNA 转移的顺式作用元件。不同类型的农杆菌其边界序列有所不同，但划线部分为完全保守序列。置于该边界内的任何外源基因均可被转化。
2、LB缺失突变后农杆菌仍能致瘤，但RB缺失会导致致瘤能力丧失，这时几乎完全没有T-DNA的转移。LB（链）5GTTTACACCACAATATATCCTGCCA 3RB（链）5TGACAGGATATATTGGCGGGTAAAC 32. Ti质粒上的Vir区（virulence region）操纵子 转化所必需的基因有virA、B、C、D、E、G。其中蛋白VirD1/D2识别T-DNA边界RB和LB；VirC识别T-DNA右边界的超驱增强子；VirD2在T-DNA底链起内切酶作用造成切刻，并与T链 5 共价结合，带有1个核定位信号NLS；VirB形成转移复合通道；VirE2为单链DNA结合蛋白，有2
3、个NLS。该操纵子的表达顺序如下：virA和virG组成型表达形成VirA和VirG蛋白 VirA被植物创伤信号分子激活激活的VirA使VirG激活 激活的VirG 诱导virC、D、E、B、F、H表达。3. 农杆菌染色体基因组相关基因：chvA、chvB（农杆菌运动、附着）、chvD、chvE（编码单糖结合蛋白、趋化性）、pscA、att、cel（合成纤维素丝，附着）。它们与农杆菌的趋化性和识别附着植物细胞有关。4. 寄主细胞表面受体5. 诱导条件: 小分子酚类化合物：如乙酰丁香酮（AS，acetosyringone）、羟基乙酰丁香酮（OH-AS，hydroxyacetosyringone）
4、；它们是植物细胞创伤反应的一部分，或创伤细胞合成木质素的一部分，是莽草酸合成途径的产物。植物细胞必须在创伤和活跃的代谢状态下才能产生AS及OH-AS。农杆菌对一系列植物酚类化合物具有趋化性，同时高浓度的AS又可使农杆菌的vir基因活化表达。这些化合物是双子叶植物细胞壁合成的前体，通常不存在于单子叶植物中，这正说明了为什么根癌农杆菌不易感染单子叶植物。若要实现农杆菌对水稻的转化，必须添加这类诱导物。糖类：如D-葡萄糖、D-木糖等。它们在Vir区基因诱导和农杆菌毒力上起一定作用。高浓度的肌醇可促进vir基因的表达。低pH：pH 5.15.8 时Vir区基因的诱导达到最高水平。合适的温度：2528。
5、virD及virG的活化必须低于28。农杆菌转化的关键步骤包括：农杆菌识别并定殖于植物细胞植物受伤信号分子诱导农杆菌vir基因表达T链形成T复合体及毒性因子输入寄主胞质T链进入寄主细胞核T链整合至寄主基因组T-DNA基因表达转化成功与否、转化效率的高低，除了与上述因素有关外，还与植物材料本身的状态有关。一般要选择活力高、细胞分裂旺盛的材料作为转化受体。就水稻而言，授粉后1215d的幼胚、幼胚及成熟胚来源的胚性愈伤组织均是很好的受体材料。三、实验材料水稻幼胚或胚性愈伤组织含目的基因质粒的农杆菌（带有潮霉素抗性筛选基因hpt）无菌滤纸四、仪器设备及用具（一）仪器设备超净工作台 恒温摇床 培养箱 台
6、式高速离心机 涡旋仪 抽滤器 高压灭菌锅 电子天平 酸度计 培养室（二）用具 微量移液器 金属药匙 牙科手术钩或细菌涂布器 100mL无菌三角瓶 直径9cm培养皿 200mL及1mL tip枪头 枪形镊 五、试剂及培养基（一）试剂 二甲基亚砜（DMSO） 乙酰丁香酮（AS） 头孢霉素（Cefazollin sodium） 羧苄青霉素（Carbenicillin sodium） 潮霉素（Hygromycin） 卡那霉素（Kanamycin） 链霉素（Streptomycin） （二）培养基1. 水稻愈伤组织培养基N6macroB5microB5vit2,4-D 2 mg/L CH 300 mg/
7、LL-proline 500 mg/L L-glutamine 500 mg/L sucrose 30g/L agar 7.5g/L pH5.82. 筛选培养基 N6macroB5microB5vit2,4-D 2 mg/L CH 300 mg/LL-proline 500 mg/L L-glutamine 500 mg/L sucrose 30g/L agar 7.5g/L Hm 50 mg/L cefa 250 mg/L carb 250 mg/L pH5.8注: cef, carb, Hm等抗生素不能高压灭菌, 应事先配成1000倍母液，抽滤除菌后冻存。培养基灭菌后冷却至约70，在超净工
8、作台内各加入1/1000 V上述三种抗生素母液，摇匀，分装为25mL / 皿。半开皿盖让平板冷却凝固后封皿。4保存。3. 农杆菌YM培养基 (单位: g/L) KH2PO4 0.5NaCl 0.2MgSO4.7H2O 0.2Mannitol 10L-Glutamine 2Yeast extract 0.3Agar 15Km50 mg/LSm50 mg/L pH 7.0 ( 抗生素Km和Sm不能高压灭菌；农杆菌培养基中加入何种抗生素要视农杆菌菌株和所含工程质粒带何种筛选标记基因而定)4. 农杆菌悬浮液MSmacro B5micro B5vit 2,4-D 2 mg/L CH 500 mg/L i
9、nositol 2g/L sucrose 30g/L AS 100mmol/L pH5.55. 共培养基MSmacro B5micro B5vit 2,4-D 2 mg/L CH 500 mg/L inositol 2g/L sucrose 30g/L AS 100mmol/L agar 7.5g/L pH5.5六、实验步骤1. 农杆菌活化取保存于70的农杆菌菌种，涂布于YM培养基平板，2728培养23d。再取该平板长出的菌落涂布于新的YM平板，2728培养23d，此时的农杆菌可用于转化。2. 愈伤组织预培养在转化前45d，挑取色泽新鲜、淡黄色、颗粒状的愈伤组织继代于水稻培养基，25暗培养。2
10、皿/人，50块/皿。3. 农杆菌侵染用药匙将农杆菌从平板上刮出，接入农杆菌悬浮液，充分搅匀，置于摇床上，25,100rpm摇菌约1h。将愈伤组织（23mm大小，50块）投入菌液感染20min，取出置于滤纸吸干表面水分。全部接入1皿共培养基（共培养基表面事先放一张灭菌滤纸，愈伤组织均匀摆放在滤纸上），半开皿盖在工作台内吹约30min，封皿。25暗培养23d。另取50块愈伤组织直接接入1 皿共培养基同样培养，作为非转化对照。4. 筛选培养将共培养材料接入筛选培养基，25块 / 皿。25暗培养。一般在筛选培养基上继代培养2次以后可以观察到鲜白的抗性愈伤组织从已基本褐化的母体愈伤组织上长出。5,试验结果
