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1、蛋白质转膜实验注意事项（用于N端测序）转膜实验操作要点1、 SDSPAGE电泳：按常规条件进行（CAPS系统:用于=20KD蛋白；TrisTricine系统：用于低分子量蛋白，也可用于高分子量蛋白）；2、 甲醇浓度：CAPS电印迹缓冲液中甲醇浓度范围是0-20（甲醇浓度高，用于低分子量蛋白转印；甲醇浓度低甚至不含甲醇的用于高分子量蛋白的转印）；3、 PVDF膜处理：取出PVDF膜，用甲醇浸泡数秒钟，然后放入CAPS电印迹缓冲液中。（注：此后的操作须防止PVDF膜干涸。如果膜变干，须重复本步骤的操作）；4、 凝胶处理：取出电泳凝胶，在CAPS缓冲液中浸泡5-10分钟。（注：转移某些强碱性蛋白pI
2、9.0时，可省略本步骤）；5、 安装转印槽子：将滤纸和海绵放入电印迹缓冲液中浸泡一下，然后按海绵、滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸、海绵的次序将电印迹夹层装好，并放入小型电转槽中；6、 转印条件：在50V恒压条件下（100-170mA）于室温下进行电印迹转移，转移时间为0.5-2小时。（注：务必排尽凝胶和PVDF膜之间的气泡。例如对70kD以上的蛋白质须延长转移时间）；7、 PVDF膜染色前处理：取出PVDF膜并用去离子水略为漂洗，用甲醇浸泡数秒钟，然后进行染色；8、 膜染色：考马斯亮蓝染色（将0.1考马斯亮蓝R-250溶于40甲醇/1乙酸中）30-50秒（切勿超过1分钟），50甲醇脱色（勤换脱色
3、液），用去离子水充分洗涤，然后晾干即可；转膜实验注意事项1） 电泳胶要求：尽可能使用厚胶，以保证膜上高载量；2） 预电泳处理：低电流跑空胶22.5小时，防止胶内杂质污染；3） 转印缓冲液：不能使用Tris-甘氨酸缓冲液，推荐使用CAPS缓冲液；4） 转印膜选择：不能用NC膜，务必使用PVDF膜；5） 染料选择：不能使用考马斯亮蓝G250，推荐使用丽春红，或者考马斯亮蓝R250；6） 转印效果：避免条带拖尾，用于测序的PVDF膜上条带应狭窄清晰；7） 脱色过程：乙醇可增加到4060，背景颜色很快脱掉后，纯净水漂洗，滤纸上晾干；8） 膜保存：膜请夹在滤纸间装于自封袋中，冰箱内可以放置36个月；9） 10CAPS（100mmol/L）缓冲液配制，方法如下：CAPS，22.13g；加去离子水至900ml；用2mol/L NaOH （约20ml）将pH值调至11.0，然后定容至1L，贮存于4C。CAPS电印迹缓冲液（含10甲醇的1CAPS）配制，方法如下：10CAPS 200ml；加入甲醇200ml；加入去离子水1600ml即可。
