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1、短期免疫抗血清制备及抗体效价检测黄健，应技1201,2012304200315摘要 通过一定程序注射颗粒性抗原或可溶性抗原免疫小鼠和家兔，是实验室制备多克隆抗血清的常用方法。虽然依据常规免疫方案可以制备出效价高、亲和力强的抗血清，但整个常规方案耗时近个多月，也容易受到免疫动物健康状况的影响和饲养成本的限制。本试验以牛血清白蛋白为抗原缩短免疫注射周期，对小鼠和家兔进行短程快速免疫。并进行效价检测，以探讨短程快速免疫方案的实效性。关键词 免疫，抗血清，抗原，ELISA主线实验分为三个小实验分别为：实验一：免疫小鼠（每组一只），家兔（每班一只）。实验二：对免疫后的小鼠和家兔进行抽血、放血，其中老鼠采
2、用断尾取血家兔采用颈动脉放血，分离抗血清 。实验三：ELISA测定抗体效价。另有一个穿插实验：血型鉴定。1 实验一：免疫用具有抗原性的物质注入到健康动物的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。抗体主要存在于血清中，经多次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集动物血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。为了制备高效价的抗血清，我们需要考虑下列五个因素。实验动物的免疫反应性，抗原的免疫原性，抗原的剂量，免疫途径，免疫时间间隔。1.1实验动物的选择常用的免疫动物有家兔、羊、马、大鼠、小鼠、豚鼠等。免疫用动物应选适龄、健壮，最好为雄性。家兔一般选择选择年龄在6个月以上当年繁殖的
3、性，体重23公斤，健康家兔三只，免疫前用金属编号牌固定兔耳，或用染料涂沫在动物的背部，作出明确的标记。同时应考虑抗原与动物的种属关系、抗原性质与动物种类、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及动物个体等因素。我们此次选用小白鼠（每组一只），家兔（每班一只）。1.2实验步骤1).编号标记35苦味酸溶液或8090苦味酸酒精饱和液分别标记左前腿上部为1，左腰部为2，左后腿为3，头部为4，背部为5，尾基部为6，右侧从前至后依次为7、8、9。2).免疫合成免疫原为2mg(半抗原约为20200 g)。家兔为300600 g/次（400），每次不超过2mL；小鼠为10100 g /次（10-20，2040 g
4、 / ml），每次不超过0.5mL。首免需要与等体积的福氏完全佐剂混合，二免与等体积的不完全福氏佐剂混合，三免、四免不用佐剂。家兔可采用皮下（脚掌），皮内，耳静脉，肌肉，淋巴结等不同部位进行免疫。小鼠则采用腹腔注射，方法为以左手抓住动物，使腹部向上，右手将注射针头于左（或右）下腹部刺入皮下，使针头向前推0.51.0cm，再以45度角穿过腹肌，固定针头，缓缓注入药液。（为避免伤及内脏，可使动物处于头低位，使内脏移向上腹。）2 实验二：抽血、放血，分离抗血清2.1取血1).老鼠采用断尾取血将小鼠放入一个盖子上打孔的恰好能放进老鼠的离心管中，尾吧从盖子孔中穿出用以固定小鼠。先用酒精棉球对小鼠尾部末端
5、消毒，然后用消毒后的手术剪剪断小鼠尾部末端。用1ml离心管接血，为了让血液尽可能快的流出，可用手从上而下按摩小鼠尾部。2).家兔采用颈动脉放血家兔固定（仰卧，身体及头部固定）-剪毛（颈部）-找颈动脉管（消毒-剖开颈部；开皮、膜、肌肉，找到气管两边的颈动脉管（桃红色，有脉动）-小心分开动脉上的肌肉、神经（2条，白色）等-开口（见图）-放血，接入100ml无菌空三角瓶。（注意：看到气管，停用所有锐器，可用止血钳、钝玻棒。注意不要剪破毛细动脉管！）2.2抗血清的分离，保存斜置装血液的三角瓶0.5-1h；用无菌玻棒剥落、松动瓶壁上的血块（利于血清析出）；原样包扎好三角瓶，与装有小鼠血液的离心管一同做好
6、记号，放进冰箱（4）过夜；次日（时间待定）：估计各班分离的血清量并观察描述血清颜色；去血块，离心取上清（3000rpm,20min），加叠氮钠（终浓度为0.1%，注意防护！），混匀，分装小管，作好标记，-20或-80保存待测。3 实验三：ELISA法测定抗体效价酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay， 简称ELISA)是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。 ELISA过程包括抗原(抗体)包被在固相载体上，加待测抗体(抗原), 再加相应酶标记抗体(抗原)，生成抗原(抗体)-待测抗体(抗原)-酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成
7、有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。3.1实验材料牛血清白蛋白（BSA) 抗原，10 g/ml溶液，包被液配制鼠抗BSA 待测抗体样品，用PBST从1：1000开始倍比稀释，连续稀释8个稀释度HRP标记羊抗小鼠IgG 二抗（按说明书稀释使用，用PBST稀释。每班8个板，480孔，总量48000 l，实际5.5 l到55ml）包被缓冲液：0.05 M pH 9.6碳酸盐缓冲液（Na2CO3 1.59克，NaHCO3 2.93克，加水900ml，调pH，再定容至1L）0.01M PBS溶液（NaCl 8.5 g, Na2HPO4.12H2O 2.85g或Na2HPO4.2H2O
8、1.13g，KCl 0.2g， KH2PO4 0.27g，蒸馏水定容至1000ml，pH7.4）PBST洗涤液：含0.05 % Tween 20的0. 0001 M 的PBS（ pH 7.4 ）底物溶液：TMB（ 3,3,5,5-四甲基联苯胺） 2M H2SO4 （市售浓硫酸为18.4 M，根据要配制的2M硫酸体积，吸管吸好相应体积浓硫酸沿着器壁缓慢加到水中）酶标板，酶标仪，保鲜膜，排枪3.2实验步骤1).加抗原：取酶标板，加入100l/孔的抗原溶液（用包被缓冲液稀释，用排枪加）2).包被抗原：保鲜膜包好， 37 1h或4 过夜抗原分子通过疏水作用力结合到96微孔板上3).封闭：甩干后以PBS
9、T（200l/孔）洗涤3次，3min/次每孔加入100 l 5%（W/V)脱脂奶粉溶液（用PBS溶液配制）保鲜膜包好， 37， 2h4).加待测血清取出包被、封闭好抗原的酶标板,甩干孔内液体以PBST（200l/孔）洗涤3次，3min/次标记各孔，加入相应稀释度的抗体100l/孔（用PBST稀释，按示意图用单枪加）37，保鲜膜包好，60min5).加二抗：甩干孔内液体以PBST（200l/孔）洗涤4次，3min/次各孔加入酶标二抗100l/孔（用PBST稀释10000X,全班每8板需48ml，实配55ml）37，保鲜膜包好，45min6).显色：甩干孔内液体以PBST（200l/孔）洗涤4次，
10、3min/次加入TMB底物溶液50L/孔避光显色10min(抽屉中），然后每孔加入50 l 的2M 硫酸终止反应3.3结果分析B2到D3的值都在0.1以下，与后面的值差别不大，说明免疫效果很不好。原因可能是多方面的。但是不可否认的是短期免疫可靠性不大，即使是做出了抗血清，也基本只能达到22到23的稀释度。4 玻片法血型鉴定（兴趣实验）4.1实验方法和步骤1).受检抗原（血样）制备： 用酒精棉球消毒手指-待干后用无菌5#针刺消毒部位-取一滴血（大绿豆大小）于盛有0.6ml生理盐水的离心管中，混匀。2).加标准诊断血清到受检血样中，血型判定： 取干净6孔白瓷盘一块（两人用），三孔先各加一滴血样-前两孔分别加入一滴抗A、抗B鉴定血清-用两根无菌牙签分别对前两孔进行混合，水平摇动-2min后观察结果。4.2实验结果分析A,B中均未有凝集现象，为O型血。
