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1、绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)是一类存在于 包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或 蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团 是其蛋白质一级序列固有的oGFP由3个外显子组成，长2.6kb；GFP是 由238个氨基酸所组成的单体蛋白，相对分子质量为27. 0kMr,其蛋白 性质十分稳定，能耐受60C处理。1996年GFP的晶体结构被解出，蛋 白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11个围 绕中心a螺旋的反平行B折叠组成，荧光基团
2、的 形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短 的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖， 对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发 色团是由其蛋白质内部第65-6 7位的Ser-Tyr-Gly 自身环化和氧化形成.1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11个围绕中心a 螺旋的反平行B折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶 的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧 光活性很重要的生色团则位于大空腔内。实验一 质粒 DNA 的分离与纯化一、实验目的掌握一种最常用的质粒DNA提取方法：碱裂解法。该法
3、用于从小量 培养物中抽提质粒DNA，比较方便、省时，提取的质粒DNA质量较高， 可用于DNA的酶切、PCR甚至测序。二、基本原理质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的 稳定的遗传单位。迄今为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链 DNA 分子，分子量范围从1kb到200kb。质粒DNA可持续稳定地处于染色体 外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着 染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。在大多数情况下质 粒 DNA 复制中的酶体系和细菌染色体复制时所用的酶是相同的。有些质 粒复制受宿主细胞复制作用的严格限制，因此每个细胞中只含一个或几 个拷贝，
4、称为严谨型质粒，有的质粒的复制受宿主细胞的控制不严，称 为松弛型质粒，它们在每个细胞中的数目可达 10-200 个拷贝。当宿主 细胞的蛋白质合成受到抑制时(例如经氯霉素处理)，细菌染色体虽不 再增加，但松弛型质粒DNA可继续被复制，以至每个细胞内的拷贝数可 以增至一千到几千。质粒具有一定的生物功能，它们往往带有一些抗药标记，当质粒 DNA 用人为的方法转化进细菌时，转化后的细菌会表现出质粒基因所具有的 新的生物表现型，例如，把一个含有抗药基因的质粒转入细菌后，原来 无抗药性的细菌则表现出抗药的新表型。借助转化菌获得的新表型特 征，可证实质粒已转入宿主细菌中，这样就可以作为转化菌的选择性标 记。
5、质粒作为基因克隆载体分子的重要的条件是获得批量的纯化的质 粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，它们都包括三 个基本的步骤：细菌的生长和质粒的扩增；菌体的收集裂解，质粒DNA 的分离；质粒DNA的纯化。1、细菌的生长和质粒的扩增丄、从琼脂培养基平板上挑取一个单菌落，接种到含适当抗生素的液体 培养基中培养。对于松弛型质粒（如pUC系列）来说，只要将培养物放 到标准的 LB 或 2YT 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提取质粒， 而不必选择性地扩增质粒DNA。但对于严谨型质粒（如PBR322）来说， 则需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以 便对质粒进行选择
6、性扩增。2、菌体的收集、裂解和质粒DNA的分离质粒分离的基本原理是利用宿主菌（一般是大肠杆菌菌株）DNA与 质粒DNA之间的两种主要性质差异：（1）大肠杆菌的染色体较一般的载 体质粒DNA大得多。（2）从细胞中提取得到的大肠杆菌DNA主体是变性 的线性分子，而大多数质粒DNA是共价闭合的环状分子。这里主要介绍 碱裂解法的基本原理：在细菌悬浮液中加入SDS （十二烷基硫酸钠）和 NaOH 使菌体裂解（有时需要先使用溶菌酶水解细胞壁）。此处理可破坏 碱基配对，故可使细菌的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于 处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时（如加入酸性的 NaAc或Kac中
7、和碱性NaOH），质粒DNA链迅速得到准确配对，重新恢复 成天然的超螺旋分子。通过离心，可以使染色体DNA与变性蛋白质、RNA 分子一起沉淀下来，而质粒超螺旋分子仍滞留于上清中。3、质粒DNA的提纯对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚抽提、RNA酶消化和酒精沉淀 等简单步骤除去残余蛋白质及RNA，达到纯化的目的。质粒DNA分子具有三种构型：共价闭合环形DNA（cccDNA, SC构型）、 开环DNA （OC构型）和线性分子（L构型）。在细菌体内，质粒DNA是以 负超螺旋构型存在的。在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的同一种质粒DNA， 尽管分子量相同，但具有不同的电泳迁移率。其中走在最前沿的是 SC D
8、NA，其后依次是L DNA和OC DNA。三、实验材料、仪器及试剂1. 在含有PEGFPN3质粒的DH5a平板上菌落上挑取菌种，置于含有5mLLB培养基的试管中。摇晃过夜。在含有pET-28a质粒的平板上挑取单菌落于另外一个试管中，同样 摇荡培养过夜。2. 使用仪器恒温培养箱，超净台，恒温摇床，制冰机，台式离心机，小型混合 器，冰箱四、实验步骤1. 取 1.5ml DH5a 培养液倒入 1.5mL eppendorf 管中，13000rpm 离心 1min。2. 重复1。3. 弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。4. 菌体沉淀重悬浮于100uL溶液I中（需剧烈振荡），室温下放置10m
9、in。5. 加入新配制的溶液II200 U1,盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管5次，以混匀内容物（千万不要振荡），冰浴5min。6. 加入150UL预冷的溶液III,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡3次, 使沉淀混匀，冰浴中15分钟，13000rpm离心5min。7. 上清液移入干净eppendorf管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24： 1）, 振荡混匀，13000rpm离心2m in。8. 将水相移入干净eppendorf管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1） 振荡混匀，13000rpm离心2m in。9. 将水相移入干净eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混
10、 匀后，置于室温下2m in，然后13000rpm离心5min。10. 弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1mL 70% 乙醇洗沉淀一次，振荡混匀后，13000rpm离心5min。11. 吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温干燥。12. 将沉淀溶于30 uL TE缓冲液（pH8.0,含20ug/mL RNaseA）中，保存在 -20C冰箱中。13. 按照同样的流程和方法将pET-28a的质粒也提出来，保存在-20C冰 箱中。五、实验结果*三弓二二实验二 质粒DNA浓度的测定一、实验目的 学习利用核酸蛋白测定仪测算核酸的浓度和纯度。二、基本原理核酸分子在260nm下有
11、最大吸光值，因此可以通过260nm下核酸的 吸光值计算核酸浓度（mg/ml）,并通过测定与280nm和230nm的比值， 估算DNA的纯度。三、实验材料与仪器1、实验材料PEGFPN3 和pET-28a DNA2. 使用仪器Eppendorf核酸蛋白测定仪，移液枪四、实验步骤1按下Eppendorf核酸蛋白测定仪|dsDNA|,比色皿中加入100卩l ddH O,I_I2blank空白对照。2取一 0.5m l离心管，吸取质粒DNA 5ul,然后再加入95ul ddH 0,2 混匀。3. 将100卩l的溶液转移到比色皿中，注意不要出现气泡。4. 按下sample,记录260nm下DNA的浓度（
12、mg/ml）。并同时记录 OD260nm/280nm, OD260nm/230nm 的比值，估测 DNA 的纯度。5. 计算质粒DNA母液的浓度=OD260nm下的浓度X20 （mg/ml）,DNA的纯度：OD260nm/280nm=1.8土0.1（如果低于1.7,说明样品中 蛋白质去除的不完全，或样品中有苯酚的污染；如果高于1.9，说明样 品中RNA去除的不完全。）OD260nm/230nm2.0实验三琼脂糖凝胶电泳一、实验目的学习掌握一种最常用的分离、鉴定、纯化DNA片段的比较方便、省 时的技术：琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。二、基本原理影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素主要有：
13、（1）DNA分子的 大小 双链DNA分子在凝胶基质中迁移的速率与其碱基对数的常用对数 成反比。分子越大，迁移的越慢，因为摩擦阻力越大，也因为大分子通 过凝胶孔径的效率低于较小的分子。（2）琼脂糖浓度 给定大小的线状 DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移速率不同。在DNA电泳迁移速 率的对数和凝胶浓度之间存在线性相关。（3） DNA的构象 超螺旋环状 （I型）、切口环状（II型）和线状（III型）DNA在琼脂糖凝胶中以不同 速率迁移。其相对迁移速率主要取决于琼脂糖凝胶的浓度和类型，其次 是电流强度、缓冲液离子强度和I型超螺旋绞紧的程度或密度。一些条 件下，I型DNA比III型迁移得快；在另一些
14、条件下，顺序可能相反。（4） 所用的电压 低电压时，DNA片段迁移率与所用的电压成正比。电场强 度升高时，高分子量片段的迁移率遂不成比例的增加。所以，当电压增 大时琼脂糖凝胶分离的有效范围反而减小。要获得大于2kb DNA片段的 良好分辨率，所用电压不应高于5-8V/cm。（5）电泳缓冲液DNA的泳 动受电泳缓冲液的组成和离子强度的影响。缺乏离子则电导率降低，DNA 或者不动或者迁移很慢。高离子强度时（如10Xbuffer）,电导率升高， 使得应用适中的电压也会产生大量的热能，最严重时凝胶会熔化，DNA 变性。三、实验材料、仪器及试剂1、实验材料质粒DNA2、使用仪器核酸电泳仪，小型混合器，冰
15、箱，蓝盾可见光透射仪四、实验步骤1、1%琼脂糖凝胶的配制(1) 加20ml 1XTBE缓冲液于三角瓶中，(2) 精确称取0.2g琼脂糖加到三角瓶中，于微波炉中加热至完全熔化，(3) 冷却至60C左右，( 4 )轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却3 0分 钟以上，(5) 将胶板除去封胶带，放入电泳缓冲液(TBE)中，使电泳缓冲 液刚好没过凝胶约1mm,轻轻拔除梳子，(6) 取5卩1质粒DNA及2ul GeneFinder混匀上样(7) 50-100V约电泳0.5T 小时(8) 蓝盾可见光透射仪观察结果。五、实验结果实验四酶切及连接1. 实验目的学习使用限制型内切酶进行DNA酶切的原理和方法。2.实验原理迄今已发现了3000多种限制性内切酶。传统上将限制性内切酶按 照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素划分为三大类。II 型酶在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链。它们产生 确定的限制片段，因此是三类限制性内切酶中唯一用于DNA分析和克隆 的一类。II型限制性内切酶中最普遍的是象EcoR I、Hind III、BamHI和Not I这样在识别序列中进行切割的酶。这一类酶是构成商业化酶的主要部 分。大部分这类酶都以同二聚体的形式结合到DNA 上，因而识别的是对 称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到DNA 上，识别非对称序列。一 些酶识别连续的序列(
