蛋白质免疫印迹

《蛋白质免疫印迹》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白质免疫印迹（8页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、蛋白质免疫印迹(Western Blot, WB )标签： western-blot 免疫印迹 蛋白质蛋白质免疫印迹(WesternBlot )可以：(1)从蛋白质混合物中检出目 标蛋白质；(2)定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况；(3) 用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。实验方法底物化学发光ECL法 Western印迹法 图解Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗 体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测， 对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。与Southern或Northe

2、rn杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯 酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质， “探针”是抗体， “显色”用标记的二抗。 实验方法经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜) 原理上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型 及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的 抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色 或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术 也广泛应用于检测蛋白水平的表达。材料 蛋白质样品试剂 丙烯酰胺SDS Tris-HCl0-巯基乙醇ddH2O甘氨酸Tri

3、s甲醇试剂 PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍 盒 胺 H2O2DAB 试剂盒仪耗器材 电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒一、试剂准备1. SDS-PAGE 试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。实验步骤 2.匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8)1.0 ml； 10%SDS 6.0 ml； 0-巯步骤基乙醇 0.2 ml； ddH2O 2.8 ml。3.转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g； Tris 5.8 g； SDS 0.37 g；甲醇 200 ml； 加 ddH2O 定容至 1000 ml。4. 0.01

4、 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO40.24 g；加 ddH2O 至 1000 ml。5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。 包被液(5%脱脂奶粉，现配)：脱脂奶粉1.0 g溶于20 ml的0.01 M PBS 中。6. 显色液：DAB 6.0 mg； 0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺 0.1 ml； H202 1.0 |jlo二、蛋白样品制备1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取( 1 )倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直 立放置一

5、会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走)。(2) 每瓶细胞加3 ml 4C预冷的PBS (0.01M pH7.27.3)。平放轻轻 摇动1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次 以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。(3) 按1ml裂解液加10 pl PMSF (100 mM),摇匀置于冰上(PMSF 要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。)(4) 每瓶细胞加400 pl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min,为使 细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。(5) 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快)，然 后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.

6、5 ml 离心管中。(整个操作尽量在冰上 进行。)(6)于4C下12000 rpm离心5 min。(提前开离心机预冷)(7)将离心后的上清分装转移倒0.5 ml的离心管中放于一20C保存。2. 组织中总蛋白的提取(1) 将少量组织块置于12 ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织 块尽量剪碎。(2) 加400 pL单去污剂裂解液裂(含PMSF)于匀浆器中，进行匀浆。 然后置于冰上。( 3)几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。(4)裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5 ml离心管中，然后 在4C下12000 rpm离心5 min，取上清分装于0.5 ml离心

7、管中并置于一 20C保存。3. 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取 由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按 1 操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：(1) 将培养液倒至15 ml离心管中，于2500 rpm离心5 min。(2) 弃上清，加入4 ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500 rpm离心 5 min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。(3) 用枪洗干上清后，加100 pL裂解液(含PMSF)冰上裂解30 min, 裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。(4) 将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4C、12000 rpm离心5 min， 取上清分装于0.5

8、ml离心管中并置于一20C保存。三、蛋白含量的测定1. 制作标准曲线(1) 从一20C取出1 mg/ml BSA，室温融化后，备用。(2) 取18个1.5 ml离心管，3个一组，分别标记为0 mg，2.5 mg，5.0 mg， 10.0 mg， 20.0 mg， 40.0 mg。(3) 按下表在各管中加入各种试剂。(4) 混匀后，室温放置2 min。在生物分光光度计(Bio-Photometer， Eppendorf)上比色分析。2. 检测样品蛋白含量(1) 取足量的1.5 ml离心管，每管加入4C储存的考马斯亮蓝溶液1 ml。室温放置30 min后即可用于测蛋白。(2) 取一管考马斯亮蓝加0

9、.15 mol/L NaCI溶液100 ml，混匀放置2分 钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按 blank 测空白样品。(3) 弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次(每次0.5 mL)，再用无 菌水洗一次。(4) 取一管考马斯亮蓝加95 ml 0.15 moI/LNaCINaCI溶液和5 ml待测蛋 白样品，混匀后静置2 min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可 同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时 间。测得的结果是5 ml样品含的蛋白量。四、SDSPAGE电泳1.

10、清洗玻璃板一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自 来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。2. 灌胶与上样(1) 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。(操作 时要使两玻璃对齐，以免漏胶。)(2) 按前面方法配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌 胶时，可用 10 ml 枪吸取 5 ml 胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度 时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。(灌胶时开始可快一 些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这 样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。)(3) 当水和胶之间有

11、一条折射线时，说明胶已凝了。再等3 min使胶充分 凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。(4) 按前面方法配4%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩 余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流 下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积 会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中 要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向 上轻轻将其拔出。（5）用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻 璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面 向外。）（6）测完蛋

12、白含量后，计算含50 ng蛋白的溶液体积即为上样量。取出上 样样品至0.5 ml离心管中，加入5xSDS上样缓冲液至终浓度为1x。（上 样总体积一般不超过151，加样孔的最大限度可加20 pl样品。）上样前 要将样品于沸水中煮5 min使蛋白变性。（7）加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻 璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样 器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若 有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲 液中洗涤3 次，以免交叉污染。3. 电泳电泳时间一般45 h,电压为40 V较好，也可用

13、60 V。电泳至溴酚兰刚 跑出即可终止电泳，进行转膜。五、转膜1. 转一张膜需准备6张7.08.3 cm的滤纸和1张7.38.6 cm的硝酸 纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切 好的硝酸纤维素膜置于水上浸2h才可使用。（用镊子捏住膜的一边轻轻 置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由 于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气 膜，这样会阻止膜吸水。2. 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、 滤纸和浸过的膜。3. 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回 擀几遍以擀走里面的

14、气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。） 在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤 纸一手用玻棒擀去其中的气泡。4. 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻 的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小 心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操 作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其 与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖 下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖 3 张滤纸并除去气泡。最后盖上另 一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进

15、行，要不断的 擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移液含 甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。）5. 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用60 V转移2 h 或 40 V 转移 3 h。6. 转完后将膜用1x丽春红染液染5 min （于脱色摇床上摇）。然后用水 冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用。六、免疫反应1 .将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色 摇床上摇动封闭 1h。2. 将一抗用TBST稀释至适当浓度（在1.5 ml离心管中）；撕下适

16、当大 小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整； 将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将 膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育 12 h 后,用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10 min；再用TBS 洗一次， 10 min。3. 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育12 h后，用TBST 在室温下脱色摇床上洗两次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min， 进行化学发光反应。七、化学发光，显影，定影1. 将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1 min后，将膜蛋白面朝 下与此混合液充分接触； 1 min 后，将膜移至另一