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1、生物分子学第8章杂交与芯片技术第八章杂交与芯片技术学习目标掌握：1核酸分子杂交的基本概念。2探针的种类与标记方法。3常见核酸分子杂交技术的原理。4DNA芯片的设计与制备。熟悉：1核酸分子杂交信号的检测方法。了解：1核酸杂交与DNA芯片技术的应用。图8-1核酸杂交原理示意图核酸杂交的分类主要有以下划分方式，根据杂交核酸分子的种类分为DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA。根据杂交探针的不同分为放射性核素杂交和非放射性核素杂交。根据杂交介质不同分为液相杂交、固相杂交和原位杂交。二、探针的类型探针指的是一段带有检测标记的与目的DNA或目的RNA特异互补的已知核苷酸序列。根据探针的制备方法及核
2、酸性质的不同，探针可分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针、寡核苷酸探针四大类。1寡核苷酸探针由公司设计合成，长度一般为1830bp。优点是：制备方便，可根据需要自行设计，避免了天然核酸探针存在的高度重复序列；由于大多数寡核苷酸探针长度只有1530bp，其中即使有一个碱基不配对也会显著影响其熔解温度。因此它特别适用于基因点突变杂交分析；比活度高，适用于大多数杂交，如DNA序列测定、Southern杂交、Northern杂交、原位杂交等。缺点是探针短，探针特异性差，与靶序列形成的杂交体稳定性差，对杂交及漂洗的温度、盐浓度等条件要求高，操作难度大，背景噪音也大。2基因组DNA探针利用机械剪
3、切或限制性内切酶消化基因组DNA制备成一定大小的DNA片段，再将这些片段插入到适当的载体中，转化宿主细胞，构建成基因组DNA文库，进而从文库中筛选出含有目的基因的阳性克隆，经扩增、提取DNA、酶切及电泳分离，即可得到足够量的基因片段，经适当的标记后，即可作为探针使用。也可采用PCR方法扩增基因组DNA片段，制备基因组DNA探针。选择此类探针时要特别注意真核基因组中存在的高度重复序列，尽可能使用基因的编码序列（外显子）作为探针，避免使用内含子及其它非编码顺序，否则探针中可能因高度重复序列的存在引起非特异性杂交而出现假阳性。优点：制备方法简单，不易降解，标记方法成熟。3cDNA探针由mRNA转录而
4、来，在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板，合成cDNA第一链，进而合成第二链。将合成的cDNA插入到适当的载体中，构建cDNA文库，然后筛选适当的阳性克隆，再进一步扩增、酶切及纯化该cDNA片段即可，见图8-2所示。也可采用PCR方法扩增。该方法的优点是双链探针，长度较长，可与靶序列形成的杂交体稳定性、特异性比寡核苷酸探针高，杂交信号强。缺点是由于是双链，必须先变性再杂交，在杂交过程中还存在自我复性现象。图8-2cDNA探针的制备4RNA探针分离的RNA或者利用噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶以双链DNA为模板在体外转录而成。优点：RNA/RNA比RNA/DNA杂交体系稳定性高。单链，不存在变
5、性和自我复性。RNA中不存在高度重复序列，非特异性杂交少。杂交后可用RNase将未杂交的游离探针消化掉，从而使本底降低。缺点：RNA容易降解，标记方法也相对复杂。三、探针的标记为确定探针是否与相应核酸分子杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。理想的探针标记物应具备以下特性：高度的灵敏性；不影响碱基配对的特异性；不影响探针分子的主要理化性质；对酶促反应活性无影响；检测方法具有高度灵敏性和高度特异性。核酸探针常用的标记物主要有两大类。一类是放射性标记物，如放射性同位素3H、32P、35S、125I等。以32P应用最普遍。优点：灵敏度高，可检测到10-18g的物质；有很高的特异
6、性，假阳性结果较少。缺点：易造成放射性污染；存在同位素的半衰期限制。第二类是非放射性同位素标记物，如地高辛素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等。优点是无环境污染、可较长时间贮存，缺点是灵敏度不高。探针标记可以全程标记，亦可对探针的3端或5端进行标记。探针的体外标记法分为化学法和酶法：化学法是利用标记物分子上的活性基因与探针分子上的基因（如磷酸基因）发生的化学反应将标记物直接结合到探针分子上。不同标记物有各自不同的标记方法，最常用的是125I标记和光敏生物素（photobiotin）标记。酶法也叫酶促标记法，预先将放射性同位素或非放射性标记物连接于NTP或dNTP上，然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子
7、掺人到探针分子中去，或将核苷酸分子上的标记基因交换到探针分子上。不同标记物有各自不同的标记方法，最常用的是125I标记和光敏生物素（photobiotin）标记。下面介绍几种常用的探针标记方法。1缺口平移法缺口平移法（nicktranslation，NT）是目前实验室最常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法。利用大肠杆菌DNA聚合酶I的多种酶促活性将标记的dNTPs掺入新合成DNA链中使探针被标记。带缺口的线状、超螺旋及环状双链DNA均可作为切口平移法的模板。首先利用DNaseI在DNA双链上造成单链切口；然后利用大肠杆菌DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除，最后在DNA
8、聚合酶I的53聚合酶催化下，以dNTP为底物，按照碱基互补的原则，在切口的3末端-OH上合成新的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入到新的DNA链中，见图8-3。该方法的优点是能够较好的控制探针的长度，且探针放射活性强。图8-3缺口平移法示意图2随机引物标记法随机引物标记法（randompriming，RP）的原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合，作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下，按53方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与模板DNA完全互补。另一单链DNA模板同样合成一条新的完全互补的DNA链。合成时，带放射性同位素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中，见图8-4。随机引物法所具
9、有的优点有：能进行双链DNA、单链DNA或RNA探针的标记；操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不当所带来的一系列问题；标记活性高；可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记。缺点是探针产量比缺口平移法低。图8-4随机引物标记法示意图3末端标记法末端标记法是将核酸片段的5末端和3末端进行部分标记，故分为3末端标记和5末端标记。3末端标记：在探针3-末端用末端转移酶掺入一个单标记的-32PdNTP。3末端标记法包括限制酶切和聚合酶合成两个过程，3标记有两种方式：大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段末端标记法和T4DNA聚合酶标记法，见图8-5。5末端标记：先用碱性磷酸酶（AP）去掉dsDNA
10、5-磷酸，在T4多核苷酸激酶的催化下，使ATP分子上的-磷酸基团转移到DNA或RNA分子的5OH基团上。因此采用-32P-ATP为底物，即可将DNA样品5端标记。但核酸样品5端必需是去磷酸的，见图8-6。图8-53末端标记法图8-65末端标记法4PCR标记法在PCR反应体系中利用标记的核苷酸作为反应底物，以待标记的DNA片段为模板，PCR扩增结束后标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中，制备成特异的探针分子，使用前必须进行探针变性处理。该方法获得的探针分子产量高。四、杂交信号的检测杂交后信号的检测方法选择取决于探针标记物的性质。常用核酸探针标记物和检测方法见表8-1。表8-1常用核酸探针的标记
11、和检测标记物性质标记分子标记方法检测方法放射性物质标记32PdNTPNT、PCR、RP放射自显影32PdNTP末端标记法放射自显影35SNT放射自显影非放射性物质标记生物素Bio-11-dUTPNT、PCR、RP酶标亲和素或酶标光敏生物素600W可见光照抗生物素抗体显色生物素化补骨脂素365紫外线照抗生物素抗体显色酶过氧化物酶化学合成法或直接法直接底物显色或用酶碱性磷酸酶化学合成法或直接法直接底物显色或用酶荧光素罗丹明和FITC合成法荧光显微镜观察或酶半抗原地高辛RP、NT酶标抗体+底物显色1放射性核素标记探针检测放射性核素标记的探针杂交后常用放射自显影进行检测，该方法基于放射性核素释放的能量
12、将照片纸感化的原理。32P标记杂交最常用的检测方法是放射自显影。该方法的基本原理是同位素在不断衰变过程中释放出-粒子，粒子撞击X光片感光层，形成潜在影像，经过显影即可成像。2非放射性核素标记探针检测非放射性核素标记的探针杂交后可选用比色或化学发光法检测。基本原理通过偶联反应和显色反应两步来实现。首先，可以通过抗原-抗体免疫反应系统与显色体系偶联。地高辛系类固醇半抗原化合物，地高辛标记探针杂交信号可通过酶联免疫法与抗地高辛抗体和碱性磷酸酶的复合物结合，然后再进行酶促显色反应。有三类显色反应可用于结果的观察。酶促显色法。最常用的酶是碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，AKP）和辣根
13、过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)，如图8-7所示；荧光法。荧光素标记的探针杂交后可通过荧光显微镜观察或者免疫组织化学法检测，主要用于原位杂交检测，最常用的为FITC；化学发光法。在化学反应中释放的能量以光的形式发射出来，某些底物在被碱性磷酸酶水解时会发光从而形成检测信号。发射光线的强度反映了酶的活性，从而体现了杂交分析的量。尼龙膜和硝酸纤维素薄膜均可用化学发光检测。图8-7酶促显色法原理第二节常见的核酸分子杂交技术核酸分子杂交反应可以在溶液内进行（液相杂交），亦可在固相支持物，如硝酸纤维素、尼龙膜上进行（固相杂交），固相杂交根据诊断目的或杂交方式不同又可分为So
14、uthern杂交（Southernblot）、Northern杂交（Northernblot）、斑点杂交（dotblot）、原位杂交（insituhybridization，ISH）、等位基因特异性寡核苷酸杂交（allelespecificoligonucleotide，ASO）、菌落杂交、反向点杂交等。所谓印迹杂交是指将凝胶中分离的生物大分子转移或者直接放在固定化介质上，然后与液相中核酸分子探针进行杂交，并加以监测分析的过程。不同的核酸分子杂交技术的用途不同，见表8-2。表8-2核酸分子的类型及用途杂交类型检测目的与范围Southern印迹杂交检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的DNA分子Nor
15、thern印迹杂交检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的RNA分子菌落杂交检测固定在膜上，经裂解从细菌体释放的DNA分子斑点杂交检测固定在膜上的DNA或RNA分子原位杂交检测细胞涂片或组织切片中的DNA或RNA分子一、原位杂交原位杂交是用已标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸按照碱基互补配对原则进行特异性杂交，然后应用组织化学或免疫组织化学法在显微镜下进行细胞内定位、定性和定量分析的方法。该技术的基本原理是根据被检测靶DNA的序列设计其互补的探针，经过变性后的单链靶DNA可以与已标记的探针分子在低温下复性，形成靶DNA与探针的杂交体，如图8-8所示。该技术可以在反应过程中保持细胞形态，甚至是单
16、个染色体的形态完整，因此通常被用于正常或异常染色体的基因定位、组织或细胞内基因表达位点的确定、转录水平的分析以及病毒或病原体感染的检测等。该技术在遗传学、病理学、基因诊断学等领域得到了广泛的应用。图8-8原位杂交示意图目前应用最多的原位杂交是荧光原位杂交技术（fluorescenceinsituhybridization，FISH），其探针应用荧光素直接或间接标记。荧光素（如异硫氰酸荧光素）直接标记的探针杂交后可使用荧光扫描共聚焦显微镜直接观察，该方法操作简单，但是灵敏度差；用生物素或地高辛间接标记的探针杂交后的结果检则，具有直观、快速、高灵敏度的特点，被广泛应用。FISH技术还被广泛应用于比较基因组杂交、基因图谱的绘制、生殖医学和病原微生物的检测等。
