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1、尿毒症患者血清对小鼠骨髓红系祖细胞集落形成影响的研究【摘要】 目的 本文采用甲基纤维素细胞培养的方法，分析尿毒症患者血清对小鼠骨髓红系祖细胞集落形成的影响，初步探讨红细胞生成抑制因子的存在。方法 选择12例尿毒症肾性贫血未透析患者为试验组，另选正常健康体检者12例为正常对照组，将实验组、正常对照组血清分别稀释成不同终浓度，采用甲基纤维素细胞培养的方法对小鼠骨髓细胞进行培养，对比不同浓度血清组红系集落形成单位、红系爆式形成单位的集落数。结果 在实验组中，与血清浓度为0的浓度组相比，与各浓度组血清共同培养的小鼠骨髓CFU-E和BFU-E的集落数均明显减少，且随血清浓度的增加，小鼠骨髓CFU-E和B
2、FU-E的集落数逐渐减少，各浓度组间差异有显着性。结论 尿毒症患者血清抑制小鼠骨髓红系祖细胞集落形成，随患者血清浓度的增加，抑制作用增强，具有剂量依赖性。【关键词】 尿毒症；贫血；红系祖细胞；集落形成单位测定【Abstract】 Objective To investigate the existence of the erythropoiesis inhibitors .Methods The present study included twelve undialyzed ESRD patients withsera from the uremic patients were added
3、to CFU-E and BFU-E culture in the concentrations ranging from % to 5%.In vitro CFU-E and BFU-E growth in the presence of sera from ESRD patients was compared with in the presence normal human subjects with the use of normal mice boneThe effects of the sera from uremic patients on CFU-E and BFU-E col
4、ony growth in concentrations ranging from % to 5% were investigated to beeffect increased with the concentrations increasing of the sera.There were not significant inhibitory effect on the CFU-E and BFU-E growth of mice bone marrow in vitro from sera of the normalThe erythropoiesis inhibitors exist
5、in uremic sera which has a dose-dependent inhibitive effects on the growth CFU-E and BFU-E of normal mice bone marrow cells.【Key words】 uremia;anemia;erythroid progenitor cell;colony-forming units assay贫血是尿毒症常见的并发症之一，严重影响患者的生活质量和疾病的预后。红细胞生成素缺乏是尿毒症贫血的主要原因，但应用人基因重组红细胞生成素治疗仍有20%30%左右的患者疗效不佳1。目前的研究显示，一些
6、尿毒症患者血EPO浓度并不下降，而是正常甚至高于正常，提示尚有其他重要因子参与肾性贫血的机制2，3。有研究表明，尿毒症患者血清能抑制骨髓红系祖细胞生长，充分透析增加毒素的消除，可改善尿毒症的贫血、提高rHu-EPO的疗效，所以提出了尿毒症某些毒素可能是红细胞生成抑制因子。但不同的研究小组获得的实验结果也存在争议。因此，近年来有关尿毒症红细胞生成抑制因子是否存在又引起学者们的关注，但目前仍没有达成共识。本文通过观察尿毒症患者血清对小鼠骨髓红系祖细胞集落形成的影响，初步探讨红细胞生成抑制因子是否存在。1 对象与方法实验对象 选择12例尿毒症肾性贫血未透析患者为实验组，原发病为慢性肾炎8例、高血压肾
7、动脉硬化2例、慢性肾盂肾炎2例，其中男5例，女7例。患者平均年龄岁，Cr范围/dl，BUN范围83135mg/dl。入选病例均无慢性炎症，无血液系统疾病或肿瘤，无铁缺乏。患者在实验前均无输血史，未使用过rHu-EPO、铁剂，实验前一个月未使用过ACEI。另选正常健康体检者12例设为对照组，男6例，女6例，平均年龄岁。实验方法标本采集与保存 实验组及对照组受试者均于清晨空腹抽取静脉血，室温静置30min后离心，分离血清，56加热灭活30min，-80冰箱保存备用。小鼠骨髓细胞红系集落形成单位、红系爆式形成单位的培养 取810周Bal-c小鼠。小鼠击头处死，75%酒精浸泡20min。立即无菌取出双
8、侧骨髓，用IMDM培养液冲出全部骨髓细胞，台盼蓝染色进行细胞计数，并用IMDM培养液调整细胞密度为1105/。培养体系和条件 %甲基纤维素，IMDM培养液，10-4mol/L巯基乙醇，15%小牛血清，3%谷氨酰胺，EPO，CSF，IL-3。将混匀的体系分别加到两个30mm培养皿中，加盖后放入37、饱和湿度的5%CO2培养箱内。培养第3天，联苯胺染色后倒置显微镜下计数含8个以上染色阳性的细胞集落为CFU-E。培养第7天，计数含50个以上染色阳性的细胞集落为BFU-E。实验方法 将实验组、对照组血清分别用IMDM培养液稀释成终浓度为0、%、%、%，观察两组不同浓度血清对小鼠骨髓CFU-E、BFU-
9、E集落生长的影响。统计学方法 所有数据均以均数标准差表示。采用双因素方差分析，组内无显着性差异则用单因素方差分析、q检验进行数据处理。以P表示有统计学差异。数据处理应用SPSS 统计软件包进行。2 结果实验组、对照组受试者不同浓度血清对小鼠骨髓CFU-E集落生长的影响 见表1。培养第3天可见CFU-E集落生长。在实验组，与血清浓度为0的浓度组相比，与各浓度组血清共同培养的小鼠骨髓CFU-E的集落数均明显减少，且随血清浓度的增加，小鼠骨髓CFU-E的集落数逐渐减少，各浓度组间差异有显着性；在对照组中，与血清浓度为0的浓度组相比，与各不同浓度血清共同培养的小鼠骨髓CFU-E的集落数差异无显着性。在
10、相同浓度时，与实验组患者血清共同培养的小鼠骨髓CFU-E的集落数较与正常对照者血清共同培养的CFU-E集落数明显减少，且差异均有显着性。表1 实验组、对照组不同浓度血清对CFU-E数量的影响注：同一组中不同浓度组之间差异有显着性；*相同浓度时两组之间差异有显着性实验组、对照组患者不同浓度血清对小鼠骨髓BFU-E集落生长的影响 见表2。培养第7天可见BFU-E集落生长。在实验组，与血清浓度为0的浓度组相比，与各浓度组血清共同培养的小鼠骨髓BFU-E的集落数均明显减少，且随血清浓度的增加，小鼠骨髓BFU-E的集落数逐渐减少，各浓度组间差异有显着性；在对照组中，与血清浓度为0的浓度组相比，与各不同浓
11、度血清共同培养的小鼠骨髓BFU-E的集落数差异无显着性。在相同浓度时，与实验组患者血清共同培养的小鼠骨髓BFU-E的集落数较与正常对照者血清共同培养的BFU-E集落数明显减少，且差异均有显着性。表2 实验组、对照组不同浓度血清对BFU-E数量的影响注：同一组中不同浓度组之间差异有显着性；*相同浓度时两组之间差异有显着性3 讨论贫血是尿毒症的常见并发症之一，贫血可引起一系列生理异常，如组织氧供给和利用下降、心排出量增加、左心室肥厚、心绞痛、充血性心力衰竭、疲劳、运动能力下降、免疫功能受损等，因此改善尿毒症患者的贫血状况至关重要。许多病理生理因素在肾性贫血的发病机制上起到一定作用，其中红细胞生成素
12、不足是其主要原因。但尽管rHu-EPO的广泛和高剂量应用，仍有许多尿毒症患者其Hb/Hct水平不能达到NKF-DOQI推荐的目标值。这种状况使患者的患病率及死亡率均增加，而且造成治疗费用的增加。有研究显示，一些患者血浆EPO水平正常甚至升高。也有研究证实，增加透析剂量有利于贫血的控制，减少rHu-EPO的用量4。此外，腹膜透析患者贫血程度较血透患者轻且rHu-EPO用量少。鉴于此原因，有学者提出，尿毒症患者血清中可能存在抑制骨髓红细胞生成的毒素，即红细胞生成抑制因子，其在肾性贫血的发生机制方面起到重要作用。本实验结果显示：与血清浓度为0的浓度组相比，与各浓度组血清共同培养的小鼠骨髓红系祖细胞C
13、FU-E和BFU-E的集落数均明显减少，且随血清浓度的增加，小鼠骨髓红系祖细胞CFU-E和BFU-E的集落数逐渐减少，各浓度组间差异有显着性；在对照组中，与血清浓度为0的浓度组相比，与各不同浓度血清共同培养的小鼠骨髓造血祖细胞CFU-E和BFU-E的集落数差异无显着性差异。提示尿毒症患者不同浓度的血清在体外具有抑制小鼠骨髓红系祖细胞CFU-E和BFU-E生长的作用，而且其抑制作用随患者血清浓度的增加，抑制作用增强，具有剂量依赖性。这一结果有力地说明了慢性肾衰患者血中存在抑制细胞生成的物质，即红细胞生成抑制因子，与Kushner等5通过对鼠骨髓细胞培养的研究发现，透析患者血清选择性抑制鼠红系祖细
14、胞的生成，且具有剂量依赖性的结果一致。目前，这些物质的具体成分还不十分清楚。有学者认为，它们可能包括了不同分子量的一组物质，但具体物质还需进一步研究证实。Radtke等6首先报道了精胺抑制幼鼠肝脏红系祖细胞的增生。有研究发现，精胺与精脒对红细胞生成素诱导的胎鼠肝细胞新合成的亚铁血红素即59Fe掺入过程具有强大的抑制作用，这可能是多胺抑制红细胞生成过程的一个机制，多胺对骨髓抑制作用似乎对红系具有相当的特异性。据推测多胺是对骨髓细胞水平的EPO起作用。慢性肾衰时血浆中EPO浓度可高于正常、正常、低于正常，这表明EI的主要作用是拮抗EPO的作用。另外还有学者提出PTH、核糖核酸、N-乙酰-丝氨酰-天
15、冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸、3-羧基-4甲基-5-丙基呋喃戊酮酸等毒素具有红细胞生成抑制作用。总之，有红细胞生成抑制作用的物质的具体成分还不十分清楚，尚需进一步研究。【参考文献】1 Sugarman JR,Frederick PR,Frankenfield DL,etclinical performance measures based on the Dialysis Outcomes Quality Initiative Clinical Practice Guidelines:process,outcomes,andJ Kidney Dis,2003,42:806-812.2 Caro J,B
16、rown S,Miller O,etlevels in uremic nephric and anephricLab Clin Med,1979,93:449-458.3 Mittman N,Sherwood JB,Chang H,etlevels in chronic dialysis patients determined by radioimmunoassay for humanLab Clin Med,1975,86:140-151.4 Movilli E,Cancarini GC,Zani R,etof dialysis reduces the doses of recombinant erythropioetin independently from the use o
