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1、土壤酶活性及微生物测定土壤酶活性测定取样工具及取样方法在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-5cm处的土约10，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中,扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考.土样在自然条件下烘干装入袋中备用。所需试剂: 酒石酸钠、NaC、阿拉伯胶、纳氏试剂、硫酸铵（NH)2O4、甲苯、苯磷酸二钠、A。32O、HAc、酚、铁氰化钾、4氨基安替吡啉、碘化钾、氯化汞、氢氧化钾、配置方法： 铵态氮标准溶液:称取477(精确至0。001g）干燥的硫酸铵(H4）2SO4溶于水中，再加水稀释至100mL，此溶液1mL含100N。往50ml容量瓶中注入10、25、40、60、7
2、5、0m标准溶液并用蒸馏水稀释至刻度，制备成的溶液在490m下比色，并绘制标准曲线。 醋酸缓冲液：H5。0,aAc。3H50g,溶于适量水中，加6mol/LHAc34，稀释至50ml。硼酸缓冲液：PH9。，80毫升.05o/l硼砂（Na2B4O7.12O)和0。2mll的硼酸混合。纳氏试剂:将碘化钾10溶于10l水中,边搅拌边慢慢地加入氯化汞饱和水溶液,直至生成的红色沉淀不再溶解为止.加入氢氧化钾0g并溶解之，再加入氯化汞饱和溶液1l，加水至00ml。静置，取上层清液，贮于棕色瓶中酚的标准溶液:（1）原液克酚溶于蒸馏水中定容至升，溶液在暗色中稳定,(2）工作液取5l原液稀释至1升(ml含0.0
3、g酚）；分别向10ml容量瓶中注入1、2、3、4、5、6、ml工作液并显色定容（分别相当于0。05、0。10、0.15、0。20、.25、03、0.35毫克酚）,待颜色稳定后，57nm比色绘制标准曲线。测定方法磷酸酶活性测定一、 试验原理土壤中的磷,很大部分以有机磷化合物的形式存在。磷酸酶能促进有机磷化合物的水解.实验表明，土壤微生物对于土壤含磷有机物质的矿化起着主要作用;土壤的磷酸酶活性,在很大程度上取决于土壤的腐殖质含量,活性磷量，能矿化有机磷化合物的微生物数量，植物类型等因素,土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力状况.二、 实验仪器恒温箱、分光光度计、三、 实验药品甲苯、苯磷酸二钠、酚、醋
4、酸缓冲液、硼酸缓冲液、铁氰化钾、4氨基安替吡啉、四、 实验步骤取5克过20目筛的风干土样于0毫升容量瓶中，用0(16滴）毫升甲苯处理，1分钟后，加入毫升苯磷酸二钠溶液(.75克苯磷酸二钠溶于水,并稀释至1升)和5毫升相应的缓冲液（碱性磷酸酶用H0的硼酸缓冲液，中性磷酸酶用70的柠檬酸缓冲液，酸性磷酸酶用H5。0的醋酸缓冲液)。仔细混合后，将反应物置于37摄氏度恒温箱中培养2小时,然后用蒸馏水定容至刻度，摇匀过滤,用5毫升水代替基质以设置对照。为了测定反应混合物中的酚量,取毫升滤液于100毫升容量瓶中,加5毫升硼酸缓冲液（pH9。)，再加入3毫升25的铁氰化钾和3毫升0。的氨基安替吡啉，摇动,溶
5、液呈粉红色，然后再加水定容,待颜色褪到稳定时(约需20分钟）,在分光光度计上于波长570纳米处测定溶液的光密度，根据用酚制备的标准曲线查出供试滤液中酚的含量.磷酸酶活性以每克土壤的酚毫克数表示。脲酶活性测定一、 试验原理 土壤的脲酶活性,与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效氮含量呈正相关。根基土壤可测得最大的脲酶活性，人们常用土壤的脲酶活性表征土壤的氮素状况。二、 实验仪器锥形瓶、定性滤纸、震荡器、分光光度计、1mm筛、三、 实验药品酒石酸钠、NCl、阿拉伯胶、纳氏试剂、铵态氮标准溶液、双蒸水四、 实验步骤1、 准确称取0。00过1mm筛的风干土样，置于1mL锥形瓶中,注入50m0%的
6、NaCl溶液，将瓶塞紧，在振荡30in(12r/mi)后,用定性滤纸过滤。2、 取20mL滤液于0mL容量瓶中，加双蒸水稀释至40m左右,加2mL2酒石酸钠,充分摇动静置5in，使其与Cd,g离子络合；3、 再加入10滴1阿拉伯胶，摇动后加2m纳氏试剂,边加边摇,定容至刻度，5in后用9比色,配制铵态氮标准溶液,绘制标准曲线,比色后求算土壤脲酶活性。4、 结果分析滴定法测定过氧化氢酶活性一、 试验原理土壤的过氧化物酶活性，与土壤的呼吸强度和土壤微生物活动相关，在一定程度上反映土壤微生物过程的强度。根际土壤的过氧化物酶活性,远较根际外土壤为高。有机质含量高的土壤，过氧化氢酶活性较强。因此，土壤过
7、氧化物酶的活性可以表征土壤总的生物学活性和肥力状况.本试验采用滴定法测定过氧化氢酶活性,即通过定量滴定酶促反应后剩余的过氧化氢量。二、 实验仪器致密滤纸、酸式滴定管、1m筛三、 实验药品双蒸馏水、H2SO、过氧化氢、KMnO、四、 实验步骤准确称取5.00g过1m筛的风干土样，置于150L锥形瓶中,注入4m双蒸馏水和m0.3%过氧化氢，另设对照，塞紧瓶盖,振荡30in（20rmi)后，注入5mL1.5mol/LH2S终止反应,用致密滤纸过滤，取滤液25，用0mlLKMnO4滴定至微红色。土壤的过氧化氢酶活性，用10土重的0.1ml/LKMnO毫升数表示。土壤微生物检测一、取样工具无菌刮铲、土样
8、采集器、镊子、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。二、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约1，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品立即进行处理或放在4冰箱中暂存。三、所需培养基及配置方法1、牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌用) 牛肉膏3，蛋白胨10g,Nal5g,琼脂15g,水1000l，pH7。07。2，121灭菌20min。2、高氏(Gaue)1号培养基（培养放线菌用） 可溶性淀粉2,KNO3 1g，aCl 0。5,2HP4 0。5g，MgSO47H2O0。5g，e4
9、0。1g，琼脂20g，水100m,p7.27。4。配制时，先用少量冷水,将淀粉调成糊状,倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其它成分，溶化后，补足水分至100ml。1灭菌20mi。、无氮培养基（自身固氮菌、钾细菌）甘露醇（或葡萄糖）1g，KH2PO4 0.2g，MgO47H2O 0。2g，Nal 0。2，CaS2H20.2g,aC3 5g,蒸馏水0，pH7。07.2,13灭菌0in。4、马丁氏（Martn)琼脂培养基(分离真菌用) 葡萄糖10g，蛋白胨g，KH2PO4 g,MgSO47H2O .g，/3000孟加拉红（rosbngal,玫瑰红水溶液)00ml,琼脂1520g,pH自然,蒸馏
10、水0，2度灭菌3min。临用前加入。03链霉稀释液10ml，使每毫升培养基中含链霉素30g。5、 蛋白胨琼脂培养基 蛋白胨5克、KH2PO4。5g，NaCl 0。2，琼脂克，gS472O 0。5，Fe40。1克，水10毫升，H7.2，一气压灭菌20分钟灭菌。四、所需药品牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、可溶性淀粉、KNO、K2HO4、MS、eSO、甘露醇(或葡萄糖)、CaSO42H2O、CaCO3、孟加拉红、链霉素五、检测方法土壤中放线菌的检测一、 试验原理应用稀释平板法从土壤中检测放线菌二、 实验仪器及试剂个土样，3个重复，共需52个灭菌培养皿；灭菌试管、灭菌吸管、灭菌三角烧瓶高氏一号培养基可
11、溶性淀粉20，KNO3 1，NCl0.5,KPO 0。g，MgSOg,FeS4.01g，琼脂20，水1000ml，pH7.274。配制时,先用少量冷水,将淀粉调成糊状,倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其它成分，溶化后，补足水分至0ml。12灭菌2in。三、 实验步骤1、 在超净工作台中,无菌称取所取土样g,分别溶于装0ml无菌水及玻璃珠三角瓶中，于摇床震荡0分钟.用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液1ml移入装9l无菌水试管中，此即为102稀释的土壤悬液。如此操作，一直到10-10.稀释。(另外,要知道所称土样的含水量)2、 倒人45恒温水浴的灭菌高氏l号培养基，水平放置，凝固待用；分别
12、无菌吸取各样品104、15、1-6、10-7稀释液，加入灭菌平皿中(每稀释度3皿，每皿lml），用玻璃涂布棒涂抹均匀，将平皿倒置于28恒温培养箱中培养。放线菌的培养时间较长，故制平板的培养基用量可适当增多3、 培养48h后，取出培养平皿,选出土样适合菌落计数的稀释度，算出同一稀释度个平皿上的菌落平均数（选择平均菌落数在330之间的)，并按下列公式进行计算,最后换算成每克干土壤中菌落形成单位。 每克土壤中菌落形成单位=同一稀释度3次重复的平均菌落数稀释倍数。土壤中细菌的检测一、 试验原理应用稀释平板法从土壤中分离细菌二、 实验仪器及试剂7个土样,3个重复,共需5个灭菌培养皿；灭菌试管、灭菌吸管、
13、灭菌三角烧瓶牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaC5，琼脂150,水00ml,pH70。2，121灭菌20min。三、 实验步骤1、 在超净工作台中,无菌称取所取土样10 g,分别溶于装90ml无菌水及玻璃珠三角瓶中，于摇床震荡3分钟。用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液1ml移入装9ml无菌水试管中，此即为0-稀释的土壤悬液.如此操作,一直到1010。稀释。(另外,要知道所称土样的含水量）2、分别无菌吸取各样品10-5、10-6、1-7、108稀释液,加入灭菌平皿中（每稀释度3皿,每皿lm）,倒人恒温水浴的灭菌牛肉膏蛋白胨培养基，混匀。（稀释倍数是情况而定）3、待培养基凝固后,将
14、平皿倒置于7恒温培养箱中培养.4、培养24h后，取出培养平皿,选出土样适合菌落计数的稀释度，算出同一稀释度个平皿上的菌落平均数(选择平均菌落数在3之间的)，并按下列公式进行计算,最后换算成每克干土壤中菌落形成单位。 每克土壤中菌落形成单位=同一稀释度3次重复的平均菌落数稀释倍数.土壤中真菌的检测一、试验原理应用稀释平板法从土壤中检测真菌二、实验仪器及试剂个土样,个重复，共需25个灭菌培养皿；灭菌试管、灭菌吸管、灭菌三角烧瓶、灭菌水马丁氏(Marin）琼脂培养基(分离真菌用） 葡萄糖10g，蛋白胨，KH2PO4 1g,MSO47H2 .5g，1/30孟加拉红(rse benl，玫瑰红水溶液)100ml，琼脂1520g，p自然,蒸馏水0l,121度灭菌30。临用前加入0。0%链霉稀释液10ml,使每毫升培养基中含链霉素30g。(链霉素在培养基融化并冷却至50摄氏度时加入，用剩的链霉素在冰箱可保存4个月，但每过一月，在1升培养基中需多加。1m）。三、实验步骤1、在超净工作台中,无菌称取所取土样10，分别溶于装90ml无菌水及玻璃珠三角瓶中,于摇床震荡3分钟。用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液ml移入装9无菌水试管中，此即为
