《稳定转染细胞系的一般建立方法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《稳定转染细胞系的一般建立方法（2页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、转染克隆的G418筛选和分离对于需要建立某些基因已经整合到染色体DNA（通过稳定或永久转染）的细胞系来说，理想的是使用选择标记，通常也是必要的。虽然有许多标记可利用，但G418（氨基糖苷类抗生素）为稳定转染试验提供了一种通用方便的选择。G418 是一种氨基糖苷类似物，在结构上与新霉素、 庆大霉素和卡那霉素相似， 它通过干扰核糖体功能来阻止哺乳动物细胞蛋白质的 合成。因此在哺乳动物细胞中表达细菌APH （氨基糖苷类磷酸转移酶）基因将产生 G418的解毒作用。这一程序提供了建立 G418选择条件的一般性指导，特殊条件由研究者个人决定。1. 建立死亡曲线，确定最佳筛选浓度（参考建立方法见附录） ；2
2、. 细胞铺板 ：转染后 24 小时将贴壁的细胞传代（传代时，注意通过在显微镜下观察，控 制细胞密度， 不能使细胞太密集， 应该少于生长表面的 50%，参考为 20%-30%）至 15cm 培养皿，加入 1520ml 培养基（ DMEM ，含血清）进行培养；3. 用最佳筛选浓度的 G418对细胞进行筛选：铺板完成后，再过24小时，抗性表达，用最佳筛选浓度的 G418进行筛选（对于 Hela细胞，一般筛选终浓度为 800ug/ml ）。具体操 作是去除旧的培养基，用PBS洗一次，将含有浓度为 800ug/ml （以Hela为例）的培养基 1520ml 加入培养皿内即可；4. 换液 ：每日及时观察细
3、胞，根据培养基的颜色和细胞生长情况，及时更换相同浓度（800ug/ml ）的培养基，大概持续筛选一周左右，直至空白对照组（未转染组）细胞死 亡大部分（至少 30%以上）；5. 撤药维持阶段 ：待空白组细胞大部分死亡后，将实验组（转染组）进行换液，此时所用 培养基含 G418 的终浓度为 200ug/ml （维持浓度） ，维持生长（若细胞仍有死亡，需要 继续降低药的浓度，参考为 50-100ug/ml ），直至筛选克隆可见为止（大约 23 天）；6. 分离克隆以获得最大数量细胞（提高克隆成活可能性） ，减少单个克隆受其他细胞污染的机会。具体操作是：a.用PBS洗含有克隆的培养物，圈出欲分离的克隆
4、。从培养皿中 除去液体，准备24孔板收集克隆；b.从培养皿中用牙签或者棉棒（经过高压）挑取已分 离出的克隆（具体操作是先用棉棒蘸一下胰酶，再蘸一下克隆）；c.在24孔板的一个孔中（事先已加入完全培养基，不含G418）剧烈摇动牙签，使细胞沉于孔中，继续挑取下一个克隆；7. C02孵箱，温育细胞约两小时 ；8. 两小时后，镜检培养皿，确定细胞是否附着 。如果已经附着，用新鲜完全培养基（含50ug/ml G418）更换24孔板培养基，除去残留的胰蛋白酶，继续培养直到培养物长满；9. 一旦小量培养物长满，转接到大的培养皿（通常先是 6 孔板），用 50ug/ml 的新鲜完全 培养基维持培养，然后与同样
5、类型的其他细胞一样处理即可。附录：死亡曲线建立方法1. G418的配制：取G418共1g溶于1mol/L的HEPES溶液1ml中，加蒸馏水至10ml,过滤 除菌，4C保存；2. 细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6h左右开始加药；3. 制备筛选培养基： 在 1001000ug/ml 范围内确定几个梯度， 比如先做个 100、400、800、 1000ug/ml ，按梯度浓度用培养基稀释 G418 制成筛选培养基；4. 加G418筛选：吸除培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基；5. 换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每隔 35d 更换一次筛选培养基；6. 确定最佳筛选浓度： 在筛选 1014d 内能够杀死所有细胞的最小 G418 浓度即为最佳筛选 浓度。
