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1、海水中细菌总数的测定 平板计数法测定方法验证报告（GB 17378.7-2007海洋监测规范 第7部分：近海生态调查和生物监测）1. 目的 通过能力确认，确认实验室在人、机、料、法、环等方面是否都达到标准要求，实验室是否具备开展用平板计数法测定海水中细菌总数的检测能力。2. 适用范围本标准规定了用平板计数法测定海水中细菌总数的测定。本标准适用于近海中细菌总数的测定。3. 职责3.1 检测人员负责按操作规程操作，确保测量过程正常进行，消除各种可能影响试验结果的意外因素。3.2复核人员负责检查原始记录。3.3技术负责人负责审核检测结果。4. 测试方法4.1 术语和定义平板计数法：平板计数法是根据单
2、一的细菌在平板培养基上，经若干时间培养，形成一个肉眼可见的子细胞群（菌落），通过计算菌落数而得之细菌数。菌落计数方法:1、 当平皿上出现较大片菌苔时，不应计数。2、 选择菌落数在30个300个之间的平皿，以平均菌落数乘以稀释倍数，即为该水样的细菌数。3、 若有两稀释度的平均菌落数均在30个300个之间，则应按两者菌落数之比值决定，比值小于2，取两者的平均数，若大于2，取其较少的菌落数。4、 若所有稀释度中各个不同稀释度的平均菌落数均大于300，则以稀释度最高的（浓度最低）的平均菌落数乘以稀释倍数。5、 若所有稀释度中各个不同稀释度的平均菌落数均小于30，则用稀释度最低的（浓度最高）平均菌落数乘
3、以其稀释倍数。6、 若所有稀释度都没有长出菌落，同事也没坚持抑制物，则报告小于1乘以其最低稀释倍数。4.2培养基与试剂4.2.1试剂配制：氢氧化钠溶液（160g/L）：称取氢氧化钠16g，溶于100mL的蒸馏水中。吐温溶液（1+2000）：取1mL吐温80，溶于2000mL的蒸馏水中。4.2.2培养基配制：2216E培养基（本培养基由青岛高科园海博生物技术有限公司提供）主要成分（g/L）A 蛋白胨 5.0g B 酵母浸粉 1.0g C 柠檬酸铁 0.1g D 氯化钠 19.45gE 氯化镁 5.98g F 硫酸钠 3.24gG 氯化钙 1.8g H 氯化钾 0.55gI 碳酸钠 0.16g J
4、溴化钾 0.08gK氯化锶 0.034g L硼酸 0.022gM硅酸钠 0.004g N氟化钠 0.0024gO硝酸钠 0.0016g P磷酸氢二钠 0.008gQ琼脂 15.0g制法：称取52.4g产品，将上述成分加热溶解，用氢氧化钠溶液（160g/L）调节pH为7.6.分装于锥形瓶中，置于高压蒸汽灭菌器中，在121下灭菌20min，将此培养基分别倒入经灭菌的平皿中，每皿约15mL，待其冷却凝固，置冰箱内保存备用。4.3检验步骤依水样量，按100mL水样加1mL吐温溶液，充分摇匀，使样品中的细菌细胞分散成单一细胞。以无菌操作法吸取1mL水样注入盛有9mL灭菌陈海水的试管内混匀，并依同法依次连
5、续稀释至所需要的稀释度。稀释度依水样含菌量而定，以每平皿的菌落数在30个300个之间为宜，每种稀释度需有3个平行样。取0.1mL稀释水样，滴入制好的平皿上，用灭菌玻璃刮棒将菌液涂抹均匀，平放于超净工作台上20min30min，使菌液渗入培养基。将此平皿置于25恒温箱内培养7d，取出计数菌落。4.4针对本标准，本实验室检测人员对同一海水样品进行人员比对，实验结果一个是1850cfu/mL，另一实验人员是1830cfu/mL，去两者平均值为1840cfu/mL，两者均偏离平均值的0.5%，在可接受范围内，以此方法增加相关人员的检测能力及对标准的理解辨别，具体见原始记录。通过人员比对这种方式表明检测人员已能理解标准，并对实验过程能有效的质量控制。5人员针对该方法，本实验室已对相关人员进行培训及考核，具体见人员培训档案。6 设备实验室现有高压灭菌锅 、电热恒温培养箱、干烤灭菌器、菌落计数器等均满足标准上的要求，并且定期委托有资质的单位进行校准，具体见相关仪器的设备档案。7 结论 仪器设备验收、试剂、人员能力验收和方法验收均符合标准的要求，实验室已具备开展海水中细菌总数的检测能力。1
