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1、实验一：植物组织渗透势的测定（质壁分离法）实验目的观察植物组织在不同浓度溶液中细胞质壁分离的产生过程，了解其用于测定植物组织渗透势的原理与方法。实验基本原理当植物组织细胞内的汁液与其周围的某种溶液处于渗透平衡状态，植物细胞内的压力势为零时，细胞汁液的渗透势就等于该溶液的渗透势。这种渗透势相等的溶液称为等渗溶液。该溶液的浓度称为等渗浓度。当用一系列梯度浓度溶液观察细胞质壁分离现象时，细胞的等渗浓度将介于刚刚引起初始质壁分离的最低浓度和尚不能引起质壁分离的最高浓度之间的溶液浓度。代入公式即可计算出其渗透势。实验用品1材料：洋葱鳞茎2器材和仪器：显微镜、载玻片及盖玻片、镊子、刀片3试剂：100mL浓
2、度1 mol/L蔗糖溶液用蒸馏水配置0.10, 0.15, 0.20, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40, 0.45, 0.50mol/L蔗糖梯度溶液各5-10mL方法步骤1、取带洋葱鳞茎下表皮（用单面刀片划约5 mm*5 mm方块用镊子将其取下），迅速分别投入各种浓度的蔗糖溶液中使其完全浸入，约10 min。2、从0.50 mol/L蔗糖溶液开始依次取出表皮薄片放在滴有同样溶液的载玻片上，盖上盖玻片，于10倍显微镜下观察，如果所有细胞都产生质壁分离的现象，则取低浓度溶液中的制片做同样观察，并记录质壁分离的相对程度。3、确定引起半数以上细胞原生质刚刚从细胞壁的角隅上分离的浓度，和不
3、引起质壁分离的最高浓度。4、在找到上述浓度极限时，用新的溶液和新鲜的叶片重复进行几次，直至把握准确为止。在此条件下，细胞的渗透势与两个极限溶液浓度之平均值的渗透势相等。5、将结果记录到下表1-1中。 测出引起质壁分离刚开始的蔗糖溶液最低浓度和不引起质壁分离的最高浓度平均值之后，代入下列公式，-s = RTiC1计算在常压下该组织细胞质液的渗透势。 其中：-s为细胞渗透势； R为气体常数0.083*105 LPa/molK； T为热力学温度，单位K；即273t，t为实验温度，单位是； i为解离系数，蔗糖为1； C1为等渗溶液的质量摩尔浓度，单位是mol/kg 则 -s = 0.083*105*（
4、273t）*1*C1 由于实验用的蔗糖溶液浓度单位为mol/L, 要经过下式进行换算 质量摩尔浓度 = 其中：C2为溶质分子的物质的量浓度（mol/L），即等渗的蔗糖浓度； 为蔗糖溶液的密度，单位是g/ml； MB为蔗糖的摩尔质量，即342.3 g/mol。注意事项 1、撕下的表皮组织必须完全浸没在溶液里思考题如何提高质壁分离法测定植物组织渗透势实验的准确性实验二 叶绿体色素的提取、分离及理化性质的鉴定 目的要求 初步掌握提取叶绿体色素的正确方法，理解分离叶绿体色素的原理。 了解叶绿体色素的光学特性在光合作用中的意义。实验基本原理 植物所呈现的颜色主要是由脂溶性的叶绿体色素和水溶性的细胞液色素
5、（主要是花青素）所致。花青素普遍存在于花卉中，其色泽随细胞液中酸碱度不同而改变，植物色素在植物中分布广泛。叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成，它们与类囊体膜蛋白结合成色素蛋白复合体而存在。 根据它们在有机溶剂中的溶解特性，可用丙酮、乙醇等有机溶剂将它们从叶片中提取出来。因为它们在不同有机溶剂中的溶解度不同以及在吸附剂上的吸附能力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。 花色素苷分布广，溶解于细胞液中，与花、果、叶的颜色有关。 颜色
6、受多因素影响：1 B环上羟基和甲氧基数目 羟基数多，吸收光向长波迁移，颜色偏蓝 羟基被甲氧基替代，吸收光向短波迁移，颜色偏红2 芳香酸对主要骨架的酯化a) 液泡中pH值 酸红碱蓝b) 营养状况 低温、缺氮、缺磷 促进化色素的形成和积累3 叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是叶绿素与蛋白质分离后，破坏更快；叶绿素中的镁可被H+取代而生成褐色的去镁叶绿素；加入铜盐作用，后者则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏。实验用品 1材料： 植物叶片 2器材和仪器：大试管、天平、研钵、量筒、移液管、烧杯、漏斗、毛细管、剪刀、滴管、滤纸。 3试剂： 丙酮、醋酸铜、6N盐酸、30
7、%氢氧化钾甲醇溶液、石英砂、碳酸钙、四氯化碳、乙醚。 方法步骤1 叶绿体色素的提取和分离 称取新鲜叶片2克，放入研钵中加丙酮5毫升（分批，即少量多次），少许石英砂，研成匀浆，再加丙酮10毫升，以漏斗过滤（最好用脱脂棉）即为色素提取液。定量至20mL，放于暗处备用。 把展层用的滤纸剪成2cm10cm的纸条，将一端剪去两侧，中间留一长约1.5 cm的窄条。 用毛细管吸取叶绿素溶液点于窄条的上方，注意一次所点溶液不易过多，风干后再点，这样重复点几次，使展层效果好一些。 在大试管（染色缸）中加四氯化碳3-5 ml及少许无水硫酸钠。将滤纸条固定在软木塞（玻璃盖）上，插入试管内，使窄条浸入溶剂中（色素点要
8、略高于液面，滤纸条边缘不可碰到试管壁），直立于阴暗处进行层析。待溶剂前沿达滤纸条上沿0.5-1.0 cm时，取出滤纸条，立刻用铅笔在溶剂前沿划线作记号。最前端橙黄色的是胡萝卜素，其次黄色为叶黄素，再下面蓝绿色为叶绿素a，最后的黄绿色为叶绿素b。2叶绿体色素的理化性质 叶绿素的荧光现象： 取上述色素丙酮提取液少许于试管中，分别观察在反射光和透射光一侧，提取液的颜色有无不同。 光对叶绿素的破坏作用： 取上述色素丙酮提取液少许分装于2支试管中，1支试管放在黑暗处（或用黑纸包裹），另一支试管放在强光下，经2-3小时后，观察两支试管中溶液颜色有何不同。 铜代反应： 取上述色素丙酮提取液少许于试管中，一滴
9、一滴加浓盐酸，直至溶液出现褐绿色，此时叶绿素分子已破坏，形成去镁叶绿素。然后加醋酸铜晶体少许，慢慢加热溶液，则又产生鲜亮的绿色，此即形成铜代叶绿素。 黄色素与绿色素的分离（皂化反应） 取上述色素丙酮提取液10mL，加到盛有20mL乙醚的分液漏斗中，摇动分液漏斗，并沿漏斗边缘加入30mL 蒸馏水，轻轻摇动分液漏斗，静止片刻，溶液即分为两层。色素已全部转入上层乙醚中，弃去下层丙酮和水，再用蒸馏水冲洗乙醚层1-2次。然后于色素乙醚溶液中加入5mL30%KOH甲醇溶液（皂化反应），用力摇动分液漏斗，静止10min，再加蒸馏水约10mL，摇动后静止分离，则得到黄色素层和绿色色素层，分别保存于试管中。实验
10、结果 1在层析纸上标出各个条带分别是什么色素。 2记录叶绿素在反射光和透射光下的颜色 3.记录光对叶绿素的破坏作用及铜代反应的结果 4.记录皂化反应的结果注意事项 1为了避免叶绿素的光分解，操作应在弱光下进行。 2研磨时间尽可能短些，以不超过5分钟为宜。并将叶片中色素浸提干净。 丙酮，乙醚等试剂易着火，远离火源思考题1.研磨提取叶绿素时加入CaCO3有什么作用？ 加多了会出现什么问题？2叶绿素a、叶绿素b、叶黄素和胡萝卜素在滤纸上的分离速度不一样，这与它们的分子量有关吗？ 3.铜在叶绿素中取代镁的作用，有何实用意义？ 4 叶绿素、荧光素酶以及绿色荧光蛋白都能产生荧光，它们的原理有什么不同？能量
11、来源有何差异？5 转GFP的植物在检测绿色荧光时为何没有看到叶绿素的红色荧光?若选择荧光标记绿色植物细胞,在选择荧光物质时应首先考虑什么问题?6 如何判断呈橙黄色的花和果实中含的是类胡萝卜素还是花色素？皂化反应 皂化反应是碱催化下的酯水解反应，尤指油脂的水解。 狭义的讲，皂化反应仅限于油脂与氢氧化钠混合，得到高级脂肪酸的钠盐和甘油的反应(还有部分水）。这个反应是制造肥皂流程中的一步，因此而得名。 取代反应：卟啉环中的Mg2+可被H2+、Cu2+、Zn2+取代，被Cu2+、Zn2+取代后仍保持绿色实验三 叶绿素a、b含量测定目的要求 熟悉分光光度法测定物质浓度的原理 掌握在未经分离的叶绿体色素溶
12、液中测定叶绿素a和b的方法及其计算。基本原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。 根据朗伯比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即ACL式中：比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，为该物质的吸光系数 各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数（ ）可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。 如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。 欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b的含量，只
13、需测定该提取液在两个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。 在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。Arnon公式 叶绿素a的最大吸收峰在663 nm，叶绿素b的最大吸收峰在645 nm，吸收曲线彼此又有重叠。根据LambertBeer定律，最大吸收峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与光密度OD之间有如下关系： Ca12.7OD6632.69OD645 Cb22.9OD6454.68OD663 CTCaCb 其中Ca、Cb和CT分别为叶绿素a的浓度、叶绿素b的浓度和叶绿素的总浓度，单位为mg/L实验
14、用品 材料： 植物叶片 器材和仪器：722型分光光度计、研钵、剪刀 、玻棒、 10 mL 容量瓶、小漏斗、滤纸、吸水纸、擦镜纸、滴管、电子天平 试剂： 80 丙酮、石英砂。 方法步骤 1. 色素提取 取新鲜叶片，剪去粗大的叶脉称取0.5 g放于研钵中加2 ml 丙酮、少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，加入80丙酮4 mL过滤后，再用4 mL 80丙酮冲洗，并用80丙酮定容至10 mL。 2. 测定吸光值 取上述色素提取液1mL，加80丙酮4 mL稀释后转入比色杯中，以80丙酮为对照，分别测定663 nm、645 nm处的吸光值。 3.计算叶绿素含量 带入公式计算叶绿素a、叶绿素b及叶绿素a和b的
15、总浓度。再根据稀释倍数分别计算每克鲜重叶片中色素的含量。（g/gFW）实验结果 1记录样品663 nm、645 nm处的吸光值 2计算样品中叶绿素a、b与总叶绿素浓度 注意事项 1. 为了避免叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进行，研磨时间应尽量短些。 2. 叶绿体色素提取液不能浑浊。可在 710 或 750 nm 波长下测量吸光值，其值应小于当波长为叶绿素 a 吸收峰时吸光值的 5 ，否则应重新过滤。 思考题 叶绿素 a 、 b 在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素 a 、 b 的定量分析 ? 为什么 ? 为什么提取叶绿素时干材料一定要用 80 的丙酮，而新鲜的材料可以用无水丙酮提取？Arnon公式推导 已知叶绿素a、b的80%丙酮提取液在
