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1、淋巴细胞标志和功能的检测人体内的淋巴细胞分为T细胞、B细胞和包括NK细胞为代表的第三群细胞，下分 若干亚群，各有其特异的表面标志和功能，据此建立许多相应的检测方法。临床上各 种类型的免疫缺陷症、自身免疫病以及肿瘤等均可出现不同群淋巴细胞数量和功能的 变化。因此计数外周血和组织内淋巴细胞及其亚群的数目或比例，以及它们所显示的 功能强弱，可藉此判断机体的细胞免疫水平，对临床认识疾病，探讨其发病机制、观 察病情、判断预后、考核疗效以及防治疾病等方面可提供极为有用的信息。第一节 T 细胞表面标志的检测一、特异性抗原的检测检测人 T 细胞的特异性抗原，曾采用抗人脑、抗人胸腺细胞和抗人 T 细胞等抗血 清
2、，通过细胞毒试验或免疫荧光染色加以鉴定。自抗白细胞分化抗原的单克隆抗体问 世以来，上述诸多方法均被新方法取而代之。常用以鉴定和检测计数 T 细胞的表面分 化抗原如表 21-1 所示。表 21-1 T 胞表面主要 CD 抗原及其特异性CD抗原特异性CD2E受体、全部T细胞和部分NK细胞CD3成熟T细胞CD4T （辅助/诱导）细胞、Mg HIV受体CD8T （杀伤/抑制）细胞、NK细胞的亚型CD25活化T细胞、IL-2受体用单克隆抗体检测 T 细胞表面抗原的方法有两大类，一类是用标记抗体着染，如 免疫荧光法、酶免疫法、生物素亲和素（或链霉亲和素）系统的 ABC 法以及免疫金 银染色法；另一类是用抗
3、体致敏的红细胞作花环试验。两类方法各有优缺点。以下叙 述有代表性的方法。（一）间接免疫荧光法本法是将分离获得的外周血单个核细胞分别与抗相应 CD 的单克隆抗体（如 CD2、 CD4、CD8）结合后，洗去游离的抗体，继加荧光素标记的抗小鼠IgG抗血清，经温育 结合后，洗去多余的标记抗体，取样制片，用荧光显微镜观察并计数约 200 个单个核 细胞，以荧光阳性细胞与计数细胞总数之比，求得相应CD抗原阳性的T百分率。如有 条件，细胞经荧光标记抗体着染后，用流式细胞仪计数，快速而准确，但需要较多的 投资，难以普及应用。二）免疫细胞化学法通常用酶免疫检测法，如APAAP酶免疫桥联法。为减少非特异性着染，可
4、选用生 物素一链霉亲和素系统试剂作ABC法染色。该类方法可用普通显微镜观察，凡呈棕黄 色的细胞为相应 CD 抗原阳性细胞，计其占总淋巴细胞的百分率。本法简便易行，不需 特殊仪器，一般试验室均可采用。（三）抗体致敏细胞花环法用相应的 CD 单克隆抗体致敏醛化的红细胞作为指示物，它与受检的细胞混匀后， 置室温片刻，继经低速离心，移放室温作短期温育或4C过夜后，重悬取样涂片染色镜 检。凡受检细胞周围粘附有3个或更多红细胞的判为花环形成细胞，共计数100200 个细胞，以花环形成数与计数细胞总数之比为相应CD抗原阳性细胞的百分率。本法需 有相应的致敏红细胞试剂，受影响的因素较前两法多。二、特异性受体的
5、检测T细胞表面有特异性绵羊红细胞（E）受体和T细胞抗原识别受体（TCR），其中E 受体曾广泛被用作鉴定和计数T细胞的标志。当人T细胞与绵羊红细胞悬液按一定比 例混匀后，置4C至少2h或过夜，T细胞表面的E受体能与绵羊红细胞结合而形成玫 瑰花样的花环（图21-1），取样涂片染色、镜检计数可得总花环形成北，亦即T细胞 的百分率。如减少淋巴细胞与绵羊红细胞的比例，两者混合后，经短时间的温育即行 取样涂片镜检计数，仍可见部分淋巴细胞形成花环，称为活性E （Ea）花环，它可能代 表T细胞的一个亚群，正常值仅为总E花环的1/31/2,约20%40%。检测Ea花 环形成细胞比总E花环形成细胞更能反映受检者的
6、细胞免疫水平。这类花环试验多种 多样，因操作简便易行，曾被广泛使用，但影响因素较多，操作稍有不同，所得结果 差异较大，因此渐被检测CD抗原方法所取代。图 21-1 显微镜下的 E 花环有些哺乳动物与人类相似，其外周血中T细胞能与某种或某几种动物的红细胞结 合形成花环，其匹配如牛、猪淋巴细胞与绵羊红细胞，狗人、猫豚鼠、豚鼠兔 因此这些相应的花环试验可以作为实验研究细胞免疫有用的技术之一。T细胞抗在识别 受体分a /p TCR和YTCR，可用相应单克隆抗体作免疫荧光检测，现仅作为研究的 工具。第二节T细胞功能的检测T细胞具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞，辅助或抑制B细胞产生抗体，对 特异性抗原
7、和促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞因子等，据此建立了一系列的检 测方法，其中有些已用作临床检测细胞免疫功能的指标。一、 T 细胞增殖试验本试验又称T细胞转化试验。T细胞在体外经某种物质刺激，细胞代谢和形态相继 发生变化，主要表现为短时间内细胞表面电荷即起变化，数小时后细胞内酶活化，在 2448h细胞内蛋白质和核酸合成增加，从而产生一系列增殖的变化，如细胞变大、细 胞浆扩大、出现空泡、核仁明显、染色质疏松、淋巴细胞转变成母细胞(图 21-2)。 因此，这种淋巴细胞增殖又称淋巴母细胞转化(lymphoblasttransformation)。淋巴 细胞增殖反应既可通过形态学观察计数，也可用阳-T
8、dR掺入法检测细胞内DNA合成量 的增加，据此判断出淋巴细胞对有关刺激的反应性与功能状态。未转化细稱过懑卑师胞书巴母細胞图 21-2 淋巴细胞转化的形态特征体外引起淋巴细胞转化的刺激物种类很多，可分为非抗原性刺激物和抗原性刺激 物两类。1 非抗原性刺激物如植物血凝系(phytoagglutinin， PHA)、刀豆素A (concanavalinA，ConA)、美洲商陆(pokeweedmitogen， PWM)和脂多糖(LPS)等, 通称促有丝分裂原(mi to gen)。其中LPS刺激B细胞，PWM可刺激T和B两类细胞， PHA 和 ConA 刺激 T 细胞增殖。2抗原性刺激物如破伤风类毒
9、素、链球菌激酶、纯化蛋白衍生物 (purifiedproteinderivative， PPD)和白色念珠菌等。同种异型组织抗原也可作为 刺激物，例如HLA，用混合淋巴细胞嘌 鄄炱鞴僖浦仓惺芴逑赴 怨T逑赴 姆从n 允抵噬弦彩且恢至馨拖赴匝椤?/p非抗原性刺激物可使正常人外周血中的淋巴细胞引起转化，与机体是否对某种抗 原致敏无关，因此属非特异的淋巴细胞转化。抗原刺激物的作用只能使相应致敏的淋 巴细胞发生转化，因此转化率大大低于非特异性转化。通常应用最多的刺激物是 PHA， 特异性抗原仅使已经相应抗原致敏的T细胞发生转化，转化率一般约5%30%,而且 需要培养45天。虽然T细胞对特异和非特异性抗
10、原的识别过程不同，但被激活后， 诱发的分裂和增殖过程却是相同。因此根据非特异性促有丝分裂原激活T细胞增殖反 应的程度，同样可推测T细胞识别特异性抗原增殖反应。目前淋巴细胞转化试验是判 断T细胞功能的一项常用的非特异性体外免疫学检测指标。该试验有形态计数法和同位素计数法两种。一)形态法其原则是将外周血液或分离的单个核细胞与适量的PHA混合，置37C培养72h, 取培养细胞作涂片染色镜检。根据细胞的大小，核与胞浆的比例，胞浆的染色性和核 结构以及有无核仁等特征，分别计数淋巴细胞、过渡型母细胞和核有丝分裂相细胞以 及成熟的小淋巴细胞，以前三者为转化细胞，每份标本计数 200 个细胞，按下列计算 转化
11、率：转化率=转化的淋巴细胞数/(转化的淋巴细胞数+未转化的淋巴细胞数) X100%在正常情况下，健康人外周血经PHA刺激的淋巴细胞转化率为60%80%，小于 50%可视为降低。形态学方法简便易行，便于基层实验室推广采用，但判读结果受主 观因素影响较大，有些细胞形态难以确认，因此重复性和可靠性较差。(二) 同位素法绝大多数外周血中T细胞通常处于细胞周期的G期，受特异性抗原或促有丝分裂 原激活后，从G期进入G期，并合成蛋白质、RNA和DNA前体物质等，为DNA复制准 备物质基础，然后进入S期，细胞合成DNA量倍增，此时若在培养液中加3H标记的DNA 前体GH胸腺嘧啶苷，3H-TdR),后者即掺入新
12、合成的DNA中，根据掺入的多少推测细胞 增殖程度。检测原则是将全血或分离的单个核细胞悬液加入含培养液的试管中，每份 样品分实验管和对照管，实验管加最适量和亚适量PHA后，移置5 % CO温箱37C培养 56h，加适量3H-TdR，继续培养16h，结束后将细胞收集在玻璃纤维膜上，递经处理， 最后用液体闪烁器测量，记录每分钟脉冲数(cpm),算出3个复管的均数土S。通常以 刺激指数(SI)表示转化能力。SI=PHA刺激管cpm均值/对照管cpm均值由于对照管组和刺激组实验条件一致，故用 SI 表示淋巴细胞增殖能力可以减少可 变因素的干扰，但对照组同位素掺入量的增加或减少，能使SI发生明显变动，以致
13、有 时不能反映真实的增殖情况，因此最好同时参照对照组和实验组的cpm加以判断。值 得强调的是目前配制的PHA多为最适浓度，在该条件下，功能略逊的细胞仍有应答能 力。如同时采用最适和亚适浓度，一些细胞免疫功能较低的T细胞对亚适浓度的PHA 则缺乏或仅呈极弱的应答，故在一定程度上可识别出应答功能较差的T细胞群。二、 T 细胞介导的细胞毒试验T细胞介导的细胞毒性(lymphocy temedia tedcy tot oxici ty，LMC)是细胞毒性T 细胞(CTL)的特性，凡致敏的T细胞再次遇相应靶细胞抗原，可表现出对靶细胞的破 坏和溶解作用，它是评价机体细胞免疫水平的一种常用指标，特别是测定肿
14、瘤患者CTL 杀伤肿瘤细胞的能力，常作为判断预后和观察疗效的指标之一。该试验的原则是选用 适当的靶细胞，常用可传代的已建株的人肿瘤细胞如人肝癌、食管癌、胃癌等细胞株 经培养后制成单个细胞悬液，按一定比例与受检的淋巴细胞混合，共温一定时间，观 察肿瘤细胞被杀伤情况，常用方法如下：一）形态学检查法淋巴细胞与肿瘤细胞混合共育后，以瑞氏染液着色，用显微镜计数残留的肿瘤细 胞数，计数淋巴细胞抑制肿瘤细胞生长的抑制率：抑制率=（对照组平均残留级肿瘤细胞数一实验组平均残留细胞数/对照组平 均残留肿瘤细胞数X100%（二）同位素法一般采用1251-UdR掺入法或5iCr释放法，以细胞毒指数或5iCr释放率表示
15、T细胞的 细胞毒活性。第三节B细胞表面标志的检测B细胞具有多种特异性抗原和受体，据此建立了相应的检测方法，一般用以研究B 细胞各分化发育阶段的特性，也可藉以鉴定和计数各阶段B细胞在人外周血和淋巴样 组织的分布以及疾病时的变化动态，为临床提供诊治相关疾病的有用信息。一、B细胞表面抗原的检测B细胞表面有CD19、CD20、CD21、CD22和CD29等分化抗原，其中有些系全部B 细胞所共有，而有些仅活化B细胞所特有，据此可用相应的CD系列单克隆抗体，通过 间接荧光免疫法、酶免疫组化或ABC法加以检测。健康成年人外周血CD20阳性细胞约 占淋巴细胞总数的8 %12%。二、B 细胞受体的检测B细胞表面
16、有膜免疫球蛋白（Smlg）、Fc受体、补体受体、EB病毒受体和小鼠红 细胞受体，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。（一） SmIg 的检测大多采用间接荧光免疫法或包括ABC法在内的酶免疫组化法，关键是选用高效价、 高特异性和高和力的荧光或酶标记的多价抗人Ig抗体，也可分别用各种类型的Ig，即 IgM、IgG、IgA、IgE等抗血清，检测带有各种类型Ig的B细胞，在人外周血中以带有 SmIgM的细胞数为最多。B细胞经荧光标记的抗Ig抗体染色，细胞膜表面呈现的荧光着色可有不同的形式, 开始均匀分布呈环状，其后集中在某些部位呈斑点状，然后又可集在一个部位呈帽状 最后可被吞饮入胞浆直至荧光消失。这一现象是由于淋巴细胞膜由双层类脂组成，上 嵌有蛋白分子，在体温条件下，
