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1、实验一 微生物(酵母)的培养基优化(指导教师:汪文俊 熊海容 王海英 肖新才 实验员: 张继泰)一实验目的：掌握微生物斜面培养基、种子培养基及发酵培养基确定方法，学会对已确定菌种确定实验室发酵工艺。 二实验原理 生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。由于酵母在液体深层通气发酵过程中是以均一混浊液的状态存在的，所以可以采用直接比色法进行测定。三仪器与试剂 全恒温振荡培养箱，分光光度计、电热恒温水浴槽、天平、电炉。试剂为葡萄糖、蔗糖、酵母浸粉、KH2PO4。四实验方法 (1)、培养基的配制(见表1,2) 表1 正交表试验设计 因素水平 葡萄糖 蔗糖 酵母膏 KH2PO4 1 1.0 0.0 0.
2、5 0.5 2 2.0 1.0 1.0 1.0 3 3.0 2.0 2.0 2.0 表2 正交表实验方案 编号葡萄糖 (A) 蔗糖 (B) 酵母膏 (C) KH2PO4 （D） 生物量 （OD）0h 12h24h36h48h60h1 (1) (1) (1) (1) 2 (1) (2) (2) (2) 3 (1) (3) (3) (3) 4 (2) (1) (2) (3) 5 (2) (2) (3) (1) 6 (2) (3) (1) (2) 7 (3) (1) (3) (2) 8 (3) (2) (1) (3) 9 (3) (3) (2) (1) （2）将上述培养基配制好以后，每250 ml三
3、角瓶装入培养基100 ml，于121下灭菌30 min，冷却。（3）冷却后接种（接种量为5），置于28培养箱进行培养。（4）测OD值：将接种0 h、 12 h、24 h、36 h、48 h、60 h不同时间的菌悬液摇均匀后于560nm波长、1cm比色皿中测定0D值。比色测定时，用以未接种的培养基作空白对照，并将0D值填入表中，最终确定最佳培养基的组成及发酵时间。 五思考题 (1)比浊计数在生产实践中有何应用价值? (2)本实验为什么采用560nm波长测定酵母菌悬液的光密度？如果你在实验中需要测定大肠杆菌生长的OD值，你将如何选择波长?实验二 紫外线的诱变育种 (指导教师:汪文俊 熊海容 王海英
4、 肖新才 实验员: 张继泰)一目的要求通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。二基本原理紫外线对微生物有诱变作用，主要引起是DNA的分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。三菌种与仪器菌种：枯草芽孢杆菌(产胞外淀粉酶)； 仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机 四操作步骤（1）菌悬液的制备（a）取培养48小时的枯草芽孢杆菌的斜面45支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。（b）将上述菌液离心（3000r/min，离心15分钟），弃
5、去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤23次，最后制成菌悬液。（c）用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。（2）平板制作将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55左右时倒平板，凝固后待用。（3）紫外线处理（a）将紫外线灯开关打开预热约20分钟。（b）取直径6cm无菌平皿2套，分别加入上述菌悬液5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿中。（c）将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟及3分钟。(4) 稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。(5)涂平板取10-4、10-5、10
6、-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液01ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。(6)培养将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37培养48小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。(7)计数将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。(8)观察诱变效应将细胞计数后的平板，分别向菌落数在56个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。与对照平板进行比较，根据结果
7、，说明诱变效应。并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜面可作复筛用。五实验结果1结果将实验结果填入下表。稀释倍数平均菌落处理时间 （数/皿）诱变剂 （min）10-410-510-6存活率%致死率%紫外线（UV）0（对照）13结果处理透明圈和菌落直径大小（）及其HC比值123456透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值UV处理对照六思考题 (1) 用于诱变的菌悬液（或孢子悬液）为什么要充分振荡？(2) 经紫外线处理后的操作和培养为什么要在暗处或红光下进行？实验三 玉米淀粉液化及糖化(指导教师:汪文俊 熊海容 王海英
8、 肖新才 实验员: 张继泰)一、 实验目的掌握用酶法从淀粉原料到水解糖的制备原理及方法。掌握粗淀粉含量和还原糖的化学测定方法。二、 实验原理发酵过程中，有些微生物不能直接利用淀粉，因此，当以淀粉为原料时，必须先将淀粉水解成葡萄糖，才能供发酵使用。一般将淀粉水解为葡萄糖的过程称为淀粉的糖化，所制得的糖液称为淀粉水解糖。发酵生产中，淀粉水解糖液的质量，与生产菌的生长速度及产物的积累直接相关。 可以用来制备淀粉水解糖的原料主要有薯类(木薯、甘薯)淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉等，根据原料淀粉的性质及采用的水解催化剂的不同，水解淀粉为葡萄糖的方法可分为酸解法、酸酶结合法和酶解法。实验室中常采用酶解
9、法制备淀粉水解糖。 酶解法是指利用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖的过程。酶解法制葡萄糖可分为两步：第l步是利用-淀粉酶将淀粉液化为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，这个过程称为液化；第2步是利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖的过程，在生产上称为糖化。淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下进行的，故也称为双酶水解法。2.1 酶法液化原理淀粉的酶法液化是以-淀粉酶为催化剂，该酶作用于淀粉的-1,4糖苷键，从内部随机地水解淀粉，从而迅速将淀粉水解为糊精及少量麦芽糖，所以也称内切淀粉酶。淀粉受到-淀粉酶的作用后，其碘色反应发生如下变化：蓝紫红浅红不显色(即碘原色)。酶法液化以生产工艺不同分为间歇法，
10、半连续和连续式；液化设备有：管式、罐式、喷射式。加酶方法有：一次加酶、二次加酶、三次加酶。根据酶制剂的耐温性分为中温酶法、高温酶法、或中温酶和高温酶混合法。本实验采用：高温酶法，间歇式，罐式，二次加酶法。2.2 酶法糖化原理淀粉的糖化是以糖化酶为催化剂，该酶从非还原末端以葡萄糖为单位顺次分解淀粉的-1，4糖苷键或-1，6糖苷键。因为是从链的一端逐渐地一个个地切断为葡萄糖，所以称为外切淀粉酶。淀粉糖化的理论收率：因为在糖化过程中，水参与反应，故糖化的理论收率为111.1。（C6H10O5)n+H2O nC6H12O6 162 18 180淀粉糖化实际收率：实际收率的计算公式：淀粉转化率：淀粉-葡
11、萄糖转化率是指100份淀粉中有多少份淀粉被转化为葡萄糖。淀粉转化率的计算：DE值：用DE值表示淀粉水解的程度或糖化程度。糖化液中还原性糖以葡萄糖计，占干物质的百分比称为DE值。DE值计算：还原糖用DNS法测定，浓度表示：葡萄糖g/100ml糖液；干物质用阿贝折光仪测定，浓度表示：干物质g/100g糖液。影响DE值的因素：糖化时间：最初糖化时，糖化速度快，DE值显著上升；但24h后，当DE值达到90以上时，糖化速度显著放慢。液化DE值与糖化DE值的关系：液化程度应控制适当，太低或太高均不利。原因是液化程度低，则粘度大，难操作；同时，由于液化程度低，底物分子少，水解机会少，影响糖化速度；液化程度低
12、，易发生老化；但液化超过一定程度，则不利于糖化酶与糊精生成络合结构，影响催化效率，造成糖化液的最终DE值低。故应在碘试本色的前提下，液化DE值越低，则糖化液的最高DE值越高。一般液化DE值应控制在12-18。酶制剂用量与糖液DE值的关系：糖化时间与糖化酶用量关系表糖化时间（h）68101624324872糖化酶用量（U/g淀粉）480400320240180150120100为加快糖化速度，可以提高酶用量，缩短糖化时间。但酶用量太高，反而使复合反应严重，最终导致葡萄糖值降低。在实际生产中，应充分利用糖化罐的容量，尽量延长糖化时间，减少糖化酶用量。糖化酶参考用量：液化DE值17，淀粉乳33，60
13、，pH4.5，酶制剂240U/g绝干淀粉。糖化时间16h。三、 实验仪器、设备和材料（1）25升罐 ；（2）小型板框过滤机压滤；（3）烘箱；（4）水桶；（5）量筒；（6）分光光度计；（7）水浴锅；（8）滴定管；（9）电炉；（10）白瓷板；（11）三角瓶；（12）阿贝折光仪；（13）玉米粉；（14）高温-淀粉酶；（15）糖化酶；（16）pH试纸；四、实验方法4.1 淀粉的液化配制30的淀粉乳（按15升配制），调节pH值至6.5，加入氯化钙(对固形物0.2)，加入液化酶(12-20U/g淀粉)，在剧烈搅拌下，先加热至72，保温15min，再加热至90，并维持30min，以达到所需的液化程度(DE值：15-18)，碘反应呈棕红色。液化结束后，再升温至120，保持5-8min，以凝聚蛋白质，改进过滤。4.2 淀粉的糖化液化结束后，迅速将料液用烟酸将pH调至4.2-4.5，同时迅速降温至60。加入糖化酶，60保温若干小时后，当用无水酒精检验无糊精存在时。将料液pH调至4.8-5.0，同时，将料液加热至80，保温20min然后将料液温度降至60-70，开始过滤。4.3 过滤在发酵罐内将料液冷却至60-70；洗净板框过滤机，装好滤布；接好板框压滤机的管道；泵料过滤；热水洗涤(60-70
