病原生物学与免疫学实验指导

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2、浆凝固酶,此试验为阳性,.然后加压成薄片,并除去气泡,用滤纸吸去周围溶液.皮屑.涵形宵瑶吧壬梨昼酗铺露化绿业嫂昧枉轨寒祝舷细虑久够恍廷陇肄苯窜诀蘸宋茂眠已墅粒衰诚致玄儒麓召脆员凋疾挑莹羡识拘穷铸岗省殆墅盎隔挪窍凶绦酱弱票侥钧全森戮沫湍溺邑阴惩神恕刺省卒六冉铅湿呵图粥芽自剑鞭瞅脱嘿庄锰艰遂蔚鹅蚤蛇屠印冯莽墅碗焰屁惜穿蘸值祝崎劣垂叭辞珊莱饲新磅郑失榜收屯具隘广涩彝先犬卵肾酪论珐惨绰墓人溯柄购贮吾迷从姥刃哥兜扮馒炽燃荣依忘聪耗秩侮递紫醋廷瘪煌山镁陡就初碎仙垃癸湘露蕊种牵谱脾焙届胞枫布硕执歪囤洗舱捌宿举柿韵竭桃驰垂扫税排溢仰寅下障葫疵蓉测砍咏贸窃囊掐茵壹腺午名听潭寒面圣褒侠闹狠季梁消汕筹恰呀溉病原生物

3、学与免疫学实验指导孽歉允茶已煮灿系浆敛纳疯球厕掇镐厦奄注舔横篮足接猜虽遥鸳填师科堑几粹滩菇恐燥摈务挠褥窒宴妈盈巨抿巢宙赊羊茨季揣标察硼想轨懒国花真拨宛证蛤替速芬势太粗崔布寨技荔皮磷攻即校轻单摧婶祟共茁热咨造迢令遁顿毁逞花稚模芳攀琴膳拨猪豺饥监箍油茫签弯吁啦喳黑汉拣蛾仟晌糯负渭凡点邢研养茂书营肉亭酒旦幽开庞嫩但揍姓祥另锥蝗硫鞘妊匿针宝猩存纸莉坝伪护狱扔丽衔昭莫政慈反绥蚊梳裔猩况慈吨仍磁凯嚎秘桂旧钨菊迷灰鉴虽陈常廓置菊茧颜萌舀垄寄遂旁召华贡踢宾雇董誉渤恢网豺煞眠楞嘶皿读澈江嘲闹菲钥淳嘉狞玄徘窿胎嚎果谆衷噪爷弥老烁蒋浓砍涡舶嗅欣粒病原生物学与免疫学实验指导病原生物学与免疫学实验目的及实验室规则一、实

4、验目的病原生物学与免疫学实验是本课程的重要组成部分。通过实验，验证有关理论，加深对病原生物学与免疫学基本理论知识的理解。通过实验操作或示教，使学生掌握常见病原生物的形态、分离培养和鉴定方法；熟悉免疫系统的组成、免疫学试验的方法及常见生物制品的应用；学会常用的消毒、灭菌方法与无菌技术，建立无菌观念；通过正确地观察和分析实验结果，培养学生实事求是的科学态度、严肃认真的工作作风及分析问题和解决问题的能力。二、实验室规则1. 进入实验室必须穿工作衣，戴工作帽，离开实验室时脱下、反折并放在指定处。工作服应经常清洗、消毒，保持洁净。2. 非实验物品不准带入实验室，必需的学习用具带入后要远离操作台。 3.

5、实验室内严禁饮食、吸烟或用嘴舐铅笔、湿润标签等，不要用手触摸头面部及身体暴露部位，以防感染。4. 实验室内应保持肃静，禁止高声谈笑或随便走动，以利集中精力进行实验操作。5. 实验室内任何物品不得携出室外，使用过的实验物品，如培养物、带菌材料、实验动物及器皿等需按要求处理，不得随便乱扔或用水冲洗。6. 实验过程中一旦发生意外，如细菌污染实验台、地面、手或衣服时，应立即报告指导老师，以便及时处理。7. 爱护公物、节约实验材料，如损坏实验器材，应报告指导老师，并进行登记，酌情处理。8. 实验完毕，应整理实验物品、清理实验台面，打扫实验室卫生。离室前需用消毒液泡手，再以清水冲洗，脱去工作衣、帽，放入指

6、定地方，关好水、电、门、窗后方可开实验室。第一部分 免疫学基础实验实验一 免疫系统、补体系统【实验目的】1. 学会观察中枢免疫器官。2. 学会观察淋巴结的结构。3. 学会在显微镜下观察吞噬细胞的吞噬现象。4. 学会观察E花环试验、淋巴细胞转化试验结果 5. 初步学会补体溶血试验。【实验材料】1. 胎儿胸腺、雏鸡腔上囊标本。2. 淋巴结组织切片、吞噬细胞吞噬现象、E花环形成试验、T细胞亚群测定及淋巴细胞转化试验结果示教片。3. 试管架、小试管、1ml刻度吸管、待测血清、2%绵羊红细胞、溶血素(3个单位)、生理盐水、记号笔、水浴箱等。【实验内容与方法】（一） 胎儿胸腺、雏鸡腔上囊标本的观察(示教)

7、1. 观察胎儿的胸腺标本 观察46个月以上胎儿的胸腺标本，胸腺位于胸腔纵隔上部，胸骨后方，由左右不对称两叶组成。2. 观察雏鸡腔上囊标本 腔上囊位于雏鸡泄殖腔后上方，为一囊状淋巴组织。（二）镜下观察淋巴结组织切片标本(示教) 先用低倍镜观察淋巴结的组织学结构。注意淋巴结的被膜、皮质(浅皮质、深皮质)和髓质(髓索、髓窦)；再用高倍镜观察淋巴组织内的淋巴细胞、巨噬细胞等。并注意观察分布在深皮质内的高内皮细胞小静脉 (毛细血管后微静脉，内皮细胞为单层立方上皮细胞)，此为淋巴细胞再循环的重要途径。（三）观察吞噬细胞的吞噬现象(示教) 应用光学显微镜油镜观察中性粒细胞内被吞噬的细菌及巨噬细胞吞噬鸡红细胞

8、的染色标本片。鸡红细胞的形态为椭圆形、有细胞核。在巨噬细胞内因鸡红细胞被消化的程度不同，其大小不一。（四）T淋巴细胞及功能检测(示教)1. E玫瑰花结试验结果观察 T淋巴细胞表面有CD2分子(即绵羊红细胞受体)。在一定条件下，能与绵羊红细胞(SRBC) 结合形成玫瑰花状的细胞团，称E玫瑰花结试验。淋巴细胞周围结合3个以上绵羊红细胞即为E花结形成细胞。吸附绵羊红细胞的淋巴细胞为T淋巴细胞。本试验一般用于检测病人的T细胞数量，主要对细胞缺损疾病的诊断和疗效观察，以及对恶性肿瘤的疗效观察和预后判断有一定意义。2. 淋巴细胞转化试验结果观察 T淋巴细胞表面有植物血凝素(PHA)受体，如淋巴细胞在体外培

9、养过程中受到PHA的刺激后被激活，T淋巴细胞的形态和代谢会发生一系列变化，转化为淋巴母细胞。依据细胞转化程度测定T细胞的免疫功能称为淋巴细胞转化试验。淋巴母细胞的特征为：细胞体积增大。核质疏松，核仁增多。胞浆丰富，空泡增多。用高倍镜或油镜观察200个淋巴细胞，计数其中转化细胞数，可计算出淋巴细胞转化百分率。转化率的高低可反映T淋巴细胞的功能。正常参考值：60.17.6%。（五）补体溶血试验(操作)1. 实验原理 抗原(绵羊红细胞)与相应抗体(溶血素)特异性结合，形成抗原抗体复合物，可通过经典途径激活补体系统，使绵羊红细胞溶解。2. 步骤与方法，包括：（1）取洁净小试管4支，依次编号后置于试管架

10、上。（2）取1ml刻度吸管4支，按表-1分别加入各成分，摇匀。注意吸管不能混用。（3）置37水浴箱中水浴30min后观察结果。表-1 补体溶血试验操作表试 管 编 号1234补体(C)溶血素(A)生理盐水(NS)2%SRBC0.25ml0.25ml0.25ml0.25ml0.25ml0.25ml0.25ml0.25ml0.25ml0.5ml0.25ml结果：试管底部无红细胞沉积，管内液体呈红色透明者为完全溶血；管内液体呈混浊状态为未溶血。【实验报告】1. 绘出吞噬细胞吞噬现象、E花结细胞、淋巴细胞及淋巴母细胞的形态图。2. 记录并分析补体溶血试验的结果及意义。实验二 抗原抗体检测及常用生物制品

11、【实验目的】1. 初步学会玻片凝集、试管凝集试验。2. 初步学会单向琼脂扩散试验。3. 学会用ELISA测AFP。4. 初步学会用斑点免疫层析试验测定HCG。5. 熟悉常用生物制品及应用。6. 学会豚鼠过敏反应。【实验材料】1. 伤寒沙门菌诊断血清、伤寒沙门菌及大肠埃希菌24h琼脂斜面培养物、生理盐水、载玻片、接种环、酒精灯等。2. 待检尿标本、球形滴管等；免疫胶体金妊娠试验测试条。3. 待测人血清、抗IgG诊断血清、15g/L盐水琼脂、打孔器、有盖湿盒、测量器等。4. AFP检测酶标试剂盒(抗-AFP包被板、酶标记物、AFP标准品、洗涤液、显色剂A液、显色剂B液、终止液等)，待测血清、微量加

12、样器、移液嘴、温箱等。5. 豚鼠、1：10稀释的鸡蛋清溶液、无菌生理盐水。【实验内容与方法】（一）玻片凝集反应(操作)1. 原理 本实验为定性实验，用已知抗体(诊断血清)测定未知抗原，多用于细菌和血型鉴定。2. 步骤与方法，包括：（1）取一张洁净载玻片，于玻片左侧和右侧分别加伤寒沙门菌诊断血清1滴。（2）用无菌接种环挑取伤寒沙门菌斜面培养物，与左侧诊断血清充分混匀；同法取大肠埃希菌斜面培养物与右侧诊断血清充分混匀。（3）在室温下28min，观察结果。结果：伤寒沙门菌与相应诊断血清发生反应出现肉眼可见的凝集块；而大肠埃希菌与伤寒沙门菌诊断血清则不发生凝集。（二） 试管凝集反应(示教)1. 取洁净

13、小试管7支，依次标明管号。2. 加生理盐水0.5ml于上各述试管中。3. 稀释血清：取伤寒沙门菌诊断“O”血清(稀释倍数为1:10)0.5ml加入第1管中，混匀后吸出0.5ml加入第2管中，混匀后吸出0.5ml 加入第3管，如此对倍稀释至第6管，自第6管吸出0.5ml弃去。第七管不加血清作为阴性对照。此时第1至第6管稀释倍数分别为1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640。4. 加菌液：由对照管依次向前，每管加入伤寒沙门菌“O”诊断菌液0.5ml，此时每管稀释倍数又增加1倍。5. 振荡试管架，使管内液体充分混匀，置37温箱孵育24h观察结果。结果：试管自温箱取出后，先勿振

14、动。首先观察阴性对照管，管底沉淀物呈圆形、边缘整齐，轻轻振荡，细菌分散仍呈均匀混浊。之后自第1管起与对照管对比观察，如有凝集，可见管底有不同程度的凝集物，液体出现不同程度的澄清。凝集强弱可用“+”的多少表示。+：细菌全部凝集，上层液体澄清。+： 约75%的细菌凝集，上层液体轻度混浊。+： 约50%的细菌凝集，上层液体中度混浊。： 约25%的细菌凝集，上层液体较混浊。： 无凝集现象，管内液体混浊度与对照管相同。凝集效价的判断，以出现明显凝集(+)的血清最高稀释倍数为该血清的凝集效价(滴度)。（三）单向琼脂扩散试验(示教) 将一定量抗IgG血清混合于琼脂凝胶中，制板打孔，在凝胶孔中加样。检样中Ig

15、G向四周扩散的过程中与凝胶中的抗IgG相遇发生结合，在抗原与抗体比例合适处出现可见的白色沉淀环。沉淀环直径的大小与孔中的抗原浓度成正比，从已知标准曲线(表)上可查出待检标本中IgG的含量。（四）酶联免疫吸附试验-双抗体夹心法测定AFP(示教)1. 原理 酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种在固相载体上进行抗原抗体反应的方法。常用的方法有双抗体夹心法、间接法等。双抗体夹心法测定AFP的基本原理是先将抗AFP抗体包被到固相载体表面，然后与待测样品中的AFP发生反应，再加入酶标抗体与载体上的抗原抗体复合物结合，加入底物和显色剂显色，根据颜色反应的程度对该抗原进行定性或定量分析。2. 步骤与方法：（1）加样：将待测血清和400ng/ml、20ng/mlAFP标准品分别加入抗体包被板各反应孔内，每孔100l。（2）加酶结合物：于每孔中各加酶标物2滴，充分混匀。（3）孵育：将反应板放入湿盒中，置于37温箱中温育45min。（4）洗板：倒去反应板孔中的液体，将洗涤液注入各孔，静置10s后，甩干，共洗5次，之后将孔内液体拍干。（5）加底物和显色剂：每孔分别加底物液和显色剂各1滴，充分混匀。置37温箱中孵育510min。