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1、第七节 肿瘤药理实验方法与技术肿瘤药理实验方法无外乎体内和体外实验两种。从实验目的上看，又可以分成抗癌作用和抗癌作用机制研究两种。一、抗癌作用研究（一）体外实验法：用培养的肿瘤细胞系进行。1、噻唑蓝（MTT）法 在培养的活细胞线粒体中与NADP相关的脱氢酶可将黄色的四氮唑（MTT）催化成不溶性的蓝紫色的甲替，将甲替用二甲基亚砜（DMSO）溶解后，利用酶标仪（试验波长570nm，参比波长450nm）测定光密度值，按照公式 实验组光密度值肿瘤细胞生长抑制率（%）=（1 - ）100% 对照组光密度值计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率。用系列浓度的药物可制作肿瘤细胞生长抑制率的量效曲线。2、染料排斥法
2、本方法是根据活细胞具有排斥某些染料的功能，而死细胞因胞膜破坏而易于被染料着色的原理，在培养的对数生长期的细胞悬液中加入伊红、台盼蓝、或苯胺黑等染料，在室温下放置5分钟后，在15分钟用血球计数板计数200个细胞。根据公式未染细胞数活细胞率（%）= 100% 细胞总数3、生长曲线法 本方法是根据肿瘤的Gompertzian生长曲线而设计。培养的肿瘤细胞在初期为指数增殖期，随着细胞密度的增加，因代谢产物的积聚和营养物质的消耗，增殖趋于减缓乃至停止，进入所谓的平台期。在培养后的的即刻、1、2、3、4、5、7天的细胞，用台盼蓝染色，细胞计数，然后取细胞对数对培养时间作图可获细胞生长曲线。1）将生长曲线外
3、延至Y轴可获得截距No，用公式计算药物对增殖细胞的杀伤力（No是对照组的的截距）2）用Nt代表接种后t小时的细胞数， 用公式TD = 0.301t / logNt - LogNo 计算药物对细胞增增时间（TD）的影响。3）取平台期每毫升的细胞均数，比较细胞生长的饱合密度（Ns）。4、集落形成法 本方法利用分裂6代以上的克隆原单细胞子细胞可形成集落成簇（每簇细胞数50）的能力，比较药物对单个肿瘤细胞增殖能力的影响。本方法有贴壁法和半固体培养法两种。1）贴壁法 需要选用贴壁生长的细胞， 按500细胞/ml的浓度接种到35mm培养皿中，培养后弃去培养基，用瑞氏-姬姆萨染色后，在20解剖显微镜下计数含
4、有50个细胞的细胞集落。2）半固体软琼脂培养法 取对数生长的细胞，用含小牛血清的培养液稀释成1000细胞/ml的悬液；溶化5%的琼脂液，并按1：9的比例与含小牛血清的新鲜培养液混合，倒入35mm培养皿（1ml/皿），室温下待琼脂凝固，取0.94ml的细胞悬液，加0.04ml的5%琼脂, 加到已制备的琼脂平皿中，室温下凝固。移入培养箱培养。在16解剖显微镜下计数直径大于75m的细胞集落。以集落形成抑制百分率对对数剂量作图，可得“S”型曲线，从曲线上求取半数抑制浓度IC50；以集落的存活分数与剂量作图，可获得克隆原细胞存活曲线，方程为S=1-(1-e-D/Do)n，S为存活分数， D 为剂量， D
5、o为存活分数每下降1/e时所需的药物剂量， n为外推值。Do越小， 药物的杀伤力越大，N越大杀死细胞的药物剂量越大。5、硫化若丹明B法（SRB）法 硫化若丹明（sulforhamine B）呈粉红色，溶于水，可与生物大分子的碱性氨基酸结合，这种结合物在波长515nm时的读数与细胞表现出良好的线性关系，可用于细胞的定量。测试的细胞先用TCA固定，去除固定液，加入SRB， 室温下静置， 然后去除未结合的SRB， 用非缓冲tris碱液溶解结合的SRB，在自动化分光光度平板读数仪（515nm波长）测定OD值。可根据下述公式计算: T - T0 生长率（%）= 100% C - T0C、T和To分别为对
6、照组细胞，为给药组细胞，另外的对照平板加药时的细胞的OD值。 T - T0杀伤率(%) = 100% T T - T050%生长抑制所需的药物浓度(GI50) = 100% C - T0 T - T0杀死50%细胞所需的药物浓度(LC50)= 100% T0(二) 在体试验法1、小鼠白血病L1210 系用甲基胆蒽诱发DBA/2小鼠而得。取接种于DBA/2小鼠第67天之腹水，制成细胞悬液，每只小鼠（DBF1或CDF1）腹腔接种活细胞1105，观察体重变化，计算平均存活时间T/C（T-治疗组存活时间，C-对照组存活时间）。T/C大于125%，并可重复，认为有抗癌活性，T/C大于150%，并可重复，
7、认为具有显著活性。2、大鼠Walker-256瘤 本瘤细胞接种在皮下或肌肉成为实体瘤，接种于腹腔则成为腹水瘤。取Walker-256瘤体制成瘤细胞悬液，按106个细胞接种于大鼠大腿肌肉。计算瘤重和T/C。重复实验T/C42%，认为有活性。3、Lewis 肺癌 是一个在C57BL/6小鼠上发现的自发性肺内未分化的上皮样癌。该癌细胞恶性程度高，皮下、肌肉接种对药物的敏感性低，但可向肺转移，静脉接种可在肺形成瘤集落。方法是取接种于C57BL/6小鼠肌肉或腋窝皮下的1315天的Lewis肺癌，制成细胞悬液接种2106个细胞于BDF1小鼠皮下或腹腔内，12天后处死动物，作皮下接种者直接摘取肿瘤称重，作腹
8、腔接种者，将双侧后肢从髋关节处剪下，荷瘤肢重减去正常肢重即为瘤重。重复实验T/C42%为有活性。二、抗癌作用机制研究（一）药物作用周期特异性研究进行药物作用细胞周期性实验必须首先制备同步化的细胞，常用的体外培养细胞同步化的方法有机械振荡法、双胸苷同步法、含羞草氨酸俘获法和离心洗脱法。1、机械振荡法 机械振荡法分离同步化细胞是基于单层贴壁生长的细胞在进入有丝分裂期时, 胞形变圆，松散地附在支持物上，利用摇晃或拍击培养瓶可以剥离出这些细胞，利用此方法可以得到较纯的M 期细胞。双胸苷同步法的原理是先以高浓度的TdR处理细胞，使细胞内的dTTP升高，后者抑制CDP 向dCDP的转变，DNA复制受阻，S
9、期细胞停滞在S 期，其它期细胞积聚在G1/S边界；撤TdR，让原处于S期的细胞完全越过S期，再给予TdR，让越过S期的细胞进入G1/S边界，然后撤去TdR，让细胞重新生长，同时进入S期。因此，本方法可以得到较纯的S期细胞。2、含羞草氨酸俘获法 含羞草氨酸可将细胞集结于G1/S边界，阻止细胞进入S期。在撤除含羞草氨酸后，细胞可同步进入S 期。3、离心洗脱法 离心洗脱法的原理是进入细胞周期的的体积呈线性增加。G1期细胞体积最小，离出口最近而被最先洗出。G2/M细胞体积最大离进气口最近而被后洗出。在上述同步化处理尚需配合以同步化程度的检测，检查的方法有两种：流式细胞光度技术和放射性同位素技术。前者通
10、过测定细胞的荧光强度来定量细胞的DNA量； 后者则利用测定掺入到DNA中的3H-胸苷（3H-TdR）或溴脱氧尿苷（BrdU）的量来获知处于S 期的细胞量。（二）药物抗微管作用 利用微管蛋白在37聚合，在冰浴上解聚的特点，测定微管蛋白或微管液的OD值，分别获得S型的聚合曲线和倒S型的解聚曲线， 比较药物对曲线的影响， 用下式计算抑制率。 实验组光密度值抑制率（%）=（1 - ）100% 对照组光密度值（三）药物与DNA结合能力检查 吸收光谱移动法 原理是DNA与药物形成复合物后吸收光谱发生改变，吸收峰产生位移，位移波长随DNA/ 药物复合物的量增加而增加。利用紫外分光光度计进行紫外吸收光谱扫描，
11、可观察到这些改变。荧光光谱移动法 原理是在激发光的激发下，DNA-药物复合物的荧光发射光谱发生改变，谱峰向短波方向移动，荧光强度增强，同时激发光谱说发生改变。用荧光分光光度计测定激发光谱和发射光谱可观察到这些变化。（四）药物造成的DNA损伤彗星（Comet）微凝胶单细胞电泳法 正常的DNA为负超螺旋结构， 在pH12.0时则完全解链。DNA受损后链断裂, 成为一个松散的结构, 在电场的作用下,松散的DNA离开细胞核向正极移动, 形成彗星似的拖尾,变换不同pH缓冲液可检测断裂的是双链还是单链。碱洗脱法 收集细胞于滤膜上，用细胞溶解液裂解细胞并洗去RNA和蛋白质，暴露DNA，用洗脱液进行洗脱，若D
12、NA发生链断裂，则易于经滤膜洗出。（五）药物对DNA拓扑异构酶的影响DNA拓扑异构酶是调节DNA空间结构的动态变化的关键性核酶，分成拓扑异构酶I和II，抑制拓扑异构酶I可以造成DNA的单链断裂，抑制拓扑异构酶II，可造成双链断裂，进而干扰DNA的复制、重组和基因表达。实验的原理是用从肿瘤细胞核提取的拓扑异构酶II处理PBR322DNA，后者是一种质粒DNA，主要存在有超螺旋、缺口状和线性DNA三种形式，琼脂糖电泳上显示出三条带，在拓扑异构酶的作用下超螺旋DNA解旋、断裂，电泳时超螺旋带减弱或消失，相应的缺口环状或线性DNA增加。如果药物对拓扑异构酶具有抑制作用，则可见超螺旋带保留。此方法亦可改
13、进为观察药物对拓扑异构酶功能的促进和抑制作用。方法是选定不能使一定量DNA完全断裂量的拓扑异构酶处理PBR322DNA后电泳可见超螺旋带，同时加入不同浓度的药物，如果药物抑制拓扑异构酶，则超螺旋带增强，若药物增强拓扑异构酶活性，则见螺旋带减弱或消失。（六）药物对细胞核酸代谢的影响 DNA和RNA合成均需要特殊氨基酸，用同位素标记前体物如3H-TdR，3H-UR可分别掺入到细胞DNA 和RNA中去， 用液闪法测定其同位素活性则可知细胞DNA和RNA 的合成情况。（七）药物对肿瘤细胞凋亡的诱导作用细胞凋亡是一种受基因调控的细胞程序性死亡过程，细胞凋亡时表现为细胞体缩小，染色质浓缩成大小不等的块状，
14、并裂解为小片段。DNA断裂长度为核小体核苷酸长度(180200碱基对)的整倍数，提取后普通的琼脂糖电泳表现为特殊的云梯状，凋亡小体形成。检查细胞凋亡的方法有：1、荧光显微镜的形态学检查 该方法是利用凋亡细胞染色质浓缩，DNA广泛裂解的特征和荧光化合物可嵌入DNA分子或以静电相互作用与DNA分子结合的原理，建立DNA的荧光探针。常用的方法是用Hoechst33342和PI联合染色，然后在荧光显微下用紫外光激发。凋亡的细胞对Hoechst33342具有高摄取比，加之染色质的高度浓缩，呈强蓝色荧光；正常细胞呈微弱荧光，坏死细胞则呈红色荧光（被PI染色）。2、流式细胞光度术 该方法的原理是用DNA结合性的荧光染料标记DNA， 因为细胞发生凋亡时，内源性核酸内切酶降解、断裂DNA，断裂生成的小分子量DNA溢出细胞外，细胞内DNA总量降低，利用流式细胞光度术可以检测出DNA的这种结构和量的变化。3、琼脂糖电泳分析法 利用该方法可检测出呈云梯状的寡聚核小体。
