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1、实验十 病毒的形态学诊断、培养方法和血清学试验目 的（一）观察病毒包涵体，并掌握其诊断意义。（二）掌握病毒的形态并了解病毒包膜的获得。（三）了解病毒培养的三种方法。（四）掌握病毒学中主要血清学反应的原理（五）熟悉病毒血凝抑制试验的测定过程内 容（一）病毒的形态学诊断1. 病毒的电镜照片（示教）2. 狂犬病毒包涵体（示教）3. 麻疹病毒包涵体（示教）（二）病毒的培养法（录像） 1. 病毒的动物接种法 2. 病毒鸡胚培养法 3. 病毒的组织培养法 （三）血凝抑制试验（操作）一、 病毒的形态学诊断病毒形态学研究方法可分为两种：一种是应用电子显微镜技术，观察其大小，形态及排列特征，以帮助诊断；另一种是
2、应用光学显微镜通过涂片染色或切片染色，观察包涵体。病毒感染细胞所产生的包涵体，其特征基本是固定的，故对病毒性疾病的诊断具有一定价值。【方法】（一）病毒的电镜照片（示教）观察腺病毒、疱疹病毒的电镜照片，注意其形态结构、大小、排列、及其包膜的形成。（二）狂犬病病毒内基（Negri）包涵体（示教）用高倍镜或油镜观察经HE（苏木紫-伊红染色）染色的死于狂犬病的犬脑组织切片，注意包涵体在细胞内的形态、位置及染色性。（三）麻疹病毒包涵体（示教）用高倍镜或油镜观察经麻疹病毒培养后，HE染色的人胚或羊膜细胞标本片，注意包涵体在细胞内的位置、形态、染色性以及细胞融合情况。二、 病毒动物接种法实验动物在病毒学研究
3、中有四方面用途：分离鉴定病毒，如乙脑病毒；连续传代通过，以减弱有毒株对人的致病力，如狂犬病病毒；制备抗血清；病毒致病机理的研究。常用的实验动物有小白鼠、地鼠、豚鼠、家兔、绵羊、鸡、猴等。在病毒学研究中，动物接种时为避免动物本身可能带有病毒，多采用实验室自己繁殖的动物。首先根据研究目的选择动物种类，对病毒致病机制的研究，则选择愈接近人类的高等动物（例如灵长类）研究结果愈有价值；其次要注意动物的年龄、性别和接种的途径等各种因素，一般年幼的动物比成年动物对病毒的敏感性高。至于接种的途径应根据病毒的嗜性决定，例如脑炎病毒以脑内注射最敏感。（一）小白鼠尾静脉接种（录像）【材料】1. 动物：小白鼠2. 病
4、毒悬液3. 碘酒、酒精、二甲苯、无菌0.25ml注射器、4号针头及小铝匣【方法】1. 将小白鼠固定在小铝匣内，露出尾部，用碘酒消毒尾部，然后用酒精棉球连续擦尾部皮肤（必要时用二甲苯擦）使血管扩张。2. 尾背和左右两侧三根血管皆为静脉，可选一根扩张较好的静脉作接种用。左手拇指捏住尾部的远端，向下弯45，右手持注射器，于弯处进针静脉，推液0.1毫升。注意：推注时遇阻力且皮下隆起发白时，表示针头不在血管内应拔出重新进针；如针头在血管内，推注时不感阻力，且可看到血管中血液由于注入液体而后退。接种后逐日观察动物发病情况。（二）小白鼠鼻内接种（录像）【材料】小白鼠、流感病毒鼠肺适应株病毒悬液、无菌小试管、
5、无菌毛细管、麻醉用乙醚、棉球及小玻瓶。【方法】1. 首先将沾有乙醚的棉球放入一清洁小玻瓶内。左手握小瓶，右手抓住小白鼠，将其头部塞入瓶口，进行全身麻醉。注意麻醉深度，不宜太浅或太深，太深时易遭致麻醉死亡或非特异性吸入性肺炎，太浅则易在滴种时打喷嚏。2. 用无菌毛细吸管吸取病毒悬液少许，连同毛细吸管插在无菌试管中备用。3. 用左手将小白鼠握在手掌中，大拇指及食指抓住小白鼠耳部使其头部朝前并呈仰卧位置，另一手取事先吸有病毒悬液的吸管，慢慢滴出一点于滴管口而不使其自然掉落，呈悬滴状。将悬滴靠近动物鼻尖，动物在呼吸时自然吸入，一般为0.030.05毫升，不宜过多。4. 小白鼠慢慢苏醒，在饲养盒中逐日开
6、始发病，发病的症状常为毛耸、咳嗽、不食、甚至死亡。解剖尸体可观察到肺炎或血性病灶。（三）小白鼠脑内接种（录像）【材料】脑炎病毒（小白鼠脑脊髓炎病毒）悬液。脑组织先用无菌生理盐水洗去血液，再加10脱脂奶盐水研磨成101悬液，然后用3000转/分离心沉淀30分钟，吸取上清液供接种用。小白鼠：3周龄，体重68克。无菌0.25毫升注射器及针头（4号）、煮针锅、碘酊、棉签。【方法】1. 以无菌0.25毫升注射器抽取脑炎病毒悬液0.1毫升，去除注射器内的气泡。2. 取出小白鼠，左手将小白鼠固定，固定时用大拇指和食指捏住小白鼠的头部，左手手掌轻轻按住小白鼠的体部。3. 右手以棉签蘸以碘酒，消毒小白鼠颞部皮毛
7、（不碰到眼）。4. 右手拿注射器在小白鼠颞部（眼与耳根连线的中点略偏耳朵的方向）刺入，进入颅腔，进针23毫米，不要插得太深，注射量为0.020.03毫升。5. 注射完毕，将用过得注射器放入煮针锅内煮沸消毒。动物一般在34天后开始发病，食欲减退，活动迟钝，毛耸，震颤，慢慢发展为麻痹，瘫痪而死亡。本法适用于一些脑炎病毒的分离培养。三、 病毒鸡胚培养法鸡胚培养法常用于痘类病毒、粘病毒和疱疹病毒的分离、鉴定、制备抗原、生产疫苗以及研究病毒性质等。鸡胚和实验动物一样，为一整体动物，有神经血管的分布及脏器的构造；鸡胚的组织分化程度低，病毒易于繁殖，感染了病毒的膜结构和液体中，含有大量病毒；鸡胚来源充足，操
8、作简单、通常本身是无菌的，对接种的病毒不产生抗体为其优点，但除产生痘疱的病毒及引起鸡胚死亡的病毒外，通常不产生特异性的感染指征，必须利用第二个试验系统来测定病毒的增殖。常用的鸡胚接种方法有四种，即绒毛尿囊膜上接种法、羊膜腔接种法、尿囊接种法及卵黄囊接种法。根据不同病毒和不同目的采用合适的接种方法。（一）尿囊腔接种法（录像）【材料】副流感病毒103稀释液，1012日龄鸡胚、无菌1毫升注射器及7号针头、电动磨蛋器、检蛋灯、弯头小镊子、蛋架、碘酒棉球、胶布、大头针、无菌试管、无菌毛细吸管。【方法】1. 选用1012日龄鸡胚，在照蛋灯上照视观察鸡胚是否存活，根据如下：小血管是否清晰；胚胎是否活动，观察
9、小鸡的眼睛黑点是否移动；蛋白一边和胎盘一边是否界限分明，蛋白一边较亮，胎盘一边暗红色，如果胎盘一边发黑或苍白都表示胚蛋已死亡。用铅笔标明天然气室，鸡胚及大血管位置，然后在绒毛尿囊膜发育区避开大血管的地方作一记号，定为注射入口。绒毛尿囊膜区血管丰富，在照视时呈现红色，几乎占据鸡蛋的二分之一。2. 用碘酒消毒注射入口和天然气室端的蛋壳，再用电动磨蛋器于注射入口和天然气室端的蛋壳上磨一小孔，勿伤及卵膜。3用大头针通过火焰消毒后刺穿气室端所开小孔的卵膜，这样可避免在注射时液体回流出来。4将鸡胚横卧于蛋架上，用无菌1毫升注射器抽取病毒液体，针头于卵壳成30交角，由注射小孔刺入0.51.0厘米，注射0.1
10、0.2毫升（图10-1）。5注射完结用胶布封口。封口前胶布用碘酒消毒，并通过火焰烧去余碘。用过的注射器用煮沸法消毒，鸡胚放入3537培养。6注射后次日，逐日观察鸡胚生活情况，孵育4872小时后移入4冰箱。注意鸡胚必须直立，令气室端朝上。7收获尿囊液之前取出鸡胚，用碘酒消毒气室端，并用镊子击破气室端卵壳，沿气室边缘小心打开一大缺口，然后用小镊子撕去卵膜及撕破绒毛尿囊膜，最后用毛细管吸取尿囊液，一般可吸得45毫升。8滴定尿囊液的病毒血凝效价。尿囊接种法适用于某些呼吸道病毒，如流感病毒、副流感病毒、新城鸡瘟病毒等的培养，惟分离培养不如羊膜腔接种法阳性率高。羊水卵白气室卵黄囊尿囊液图 10-1 鸡胚尿
11、囊腔接种法（二）绒毛尿囊膜上接种法（录像）【材料】牛痘苗病毒103稀释液、1013日龄鸡胚、橡皮乳头、眼科镊子或小剪刀、无菌培养皿、无菌生理盐水，其余同尿囊腔接种法。【方法】1选用1013日龄鸡胚，在照蛋灯上照视观察是否活胚蛋，用铅笔划下绒毛尿囊膜发育的界限。2将胚蛋横卧于蛋座上，使其绒毛尿囊膜部位朝上，用碘酒消毒绒毛尿囊膜部位和天然气室端的中心部，待干后即用磨蛋器轻轻在绒毛尿囊膜中心部磨一三角形窗口（每边一厘米许），磨破卵壳而不使卵膜破裂，同时用磨蛋器于气室端开一小孔。注意：已磨好之鸡胚必须于12小时内接种，否则绒毛尿囊膜易与卵壳粘着。3用分离针或大头针通过火焰消毒，穿通天然气室端所锯小孔；
12、并用分离针或大头针轻轻划破卵壳，露出三角形卵膜，最好将分离针或大头针30角度自上往下压迫卵膜一个小口，这样不致损伤绒毛尿囊膜。4立即用橡皮乳头在天然气室一端小孔吸气23次，目的将天然气室的空气吸去，而上面所开的洞口进入空气，形成一个人工气室，可在照蛋灯上照视一下，看天然气室是否消失，如未消失则尚需再吸气数次（图10-2）。5用小镊子通过火焰灭菌，稍待冷却后将三角形窗口的卵膜撕去、暂时盖以无菌培养皿防止污染，然后用消毒注射器吸取牛痘苗悬液（103稀释液，内加适量的链霉素及青霉素），揭去培养皿，于窗口滴入0.10.2毫升病毒液，注毕后窗口用胶布封口，封口前胶布用碘酒消毒，并通过火焰，烧去余碘。用过
13、的注射器煮沸消毒。6孵育于37温箱，每日观察生活情况，接种103稀释的牛痘苗后的鸡胚一般不死亡，但也可能在3天之后发生死亡，如发现死亡则立即放入普通冰箱，如不死亡则培养45日后放入普通冰箱，等待观察检查。7将感染病毒的鸡胚自冰箱中取出，用碘酒消毒人工气室面，然后用镊子撕去胶布并将卵壳的三角形窗口扩大，以便剪取绒毛膜，此时在明亮处可清楚地看到牛痘斑，呈白色点状，有时融合成一堆或一片。8左手用小镊子镊起绒毛尿囊膜，右手用小剪顺卵壳四周剪下绒毛尿囊膜放入无菌培养皿内，并用无菌生理盐水洗涤12次，再将膜张开，膜上牛痘斑就看得更为清楚。绒毛尿囊膜上接种法，除适用于天花，牛痘等病毒外，尚适用于单纯疱疹病毒
14、和其它一些病毒，但其它一些病毒不如天花、牛痘、单疱疹病毒那样具有明显的病斑。绒毛尿囊膜羊水卵白卵黄囊尿囊液图10-2 鸡胚绒毛尿囊膜上接种（三）羊膜腔接种法（录像）【材料】副流感病毒103稀释液、910日龄鸡胚、灭菌液体石蜡、其余同尿囊腔接种法。【方法】1所用鸡胚在使用前一天，将鸡胚直立卵盘培养，使其胚胎向上，便于操作。 2接种前检查鸡胚生活情况，并用铅笔画出天然气室和胚胎的位置，然后用磨蛋器沿天然气室的边缘和胚胎位置近处，锯一方形小窗（每边约1厘米许，如图10-3）。3用小镊子挑去方形卵壳和撕去卵膜，再用无菌吸管，吸取石蜡油少许，滴入2滴，石蜡油在气室面的卵膜上很快散开，使膜透明，这样在鸡蛋
15、照明灯或检蛋灯上，可清楚地观察到整个鸡胚。4用无菌1毫升注射器抽取少许流感病毒液体，将鸡蛋直立于照明灯或检蛋灯上，针头自窗口对着鸡胚直下，穿过绒毛尿囊膜，羊膜腔、推动注射器，注入0.10.2毫升，针头刺入时注意勿伤及鸡胚本身，最好从小鸡的颈部空隙中插入。5注射完毕后，用胶布封口（胶布先经碘酒消毒和通过火焰烧去余碘处理）。用过的注射器煮沸消毒处理。鸡胚放入3537培养4872小时。6自注射后次日起逐日检查鸡胚的生活情况，2日以内死亡者多为非特异性损伤而致死；2日后死亡者视为特异性死亡，流感或副流感病毒103稀释注射时，一般不引起死亡。收获病毒之前将鸡胚移入普通冰箱1824小时，将鸡胚冻死，以减少收获时的出血。7冰箱取出鸡胚，碘酒消毒鸡蛋气室端，撕去胶布并将蛋壳窗口扩大，用小镊子撕破卵膜及绒毛尿囊膜，然后用毛细管吸出尿囊液弃去，尿囊液吸完后，左手持镊
