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1、西昌学院毕业论文 石榴贮藏期褐斑病防治的研究毕 业 论 文题 目：石榴贮藏期褐斑病防治的研究学 院：轻化工程学院专 业：食品质量与安全学生姓名：李少华学 号：1104090037年级：2011级指导教师：姚 昕完成时间：2015年5月20日目 录摘要1关键词1Abstract1Key words10 前言11 材料和方法21.1 材料21.2 试验方法21.2.1 PDA培养基的制备和灭菌21.2.2 分离纯化21.2.3 病原菌的形态特征观察31.2.4 病原菌的科赫氏法则鉴定31.3 不同药剂对石榴果褐斑病的室内毒力测定31.3.1 供试药剂31.3.2 室内毒力初筛测定方法31.3.3
2、室内毒力复筛测定方法41.3.4 食品添加剂对石榴病害防治41.4 数据处理52 结果与分析52.1 病原菌鉴定52.1.1 症状观察52.1.2 病原菌的培养性状及形态特征52.1.3 病原菌科赫氏法则鉴定62.2 不同防腐剂对病原菌的室内毒力测定与分析62.2.1 不同食品添加剂对病原菌的初筛室内毒力测定62.2.2 不同食品添加剂对病原菌的复筛室内毒力测定72.2.3 3种食品添加剂对石榴贮藏期病害的防治效果83 结论9参考文献10致谢11独撰声明11石榴贮藏期褐斑病防治的研究摘 要：从石榴果实上分离纯化得到石榴褐斑病的病原菌，根据病害症状特点、培养性状、病原菌形态特征和致病性测定等方面
3、鉴定。选择20种食品添加剂，对其进行室内毒力试验和浸果试验， 筛选出3种食品添加剂，对贮藏期石榴褐斑病的发生具有较好的抑制效果，分别是2-萘酚、脱氢乙酸钠和聚赖氨酸，其中抑制效果最好的是2-萘酚，EC50为33.5771mg/L，EC90为122.3162mg/L，防治效果为48.53%。关键词：石榴 褐斑病 毒力测定 防治Studies on Control of Pomegranate Brown Spot Disease in Storage PeriodAbstract: One kind of fungus was isolated from brown spot disease o
4、f Pomegranate. According to determination of disease symptoms, incubation properties, morphological characteristics, the pathogen was identified .20 kinds of food additives are used for the indoor toxicity test and the dipping fruit test. 3 kinds of food additives had better inhibition effect for br
5、own spot disease of pomegranate. They were 2-hydroxynaphthalen, sodium dehydroacetate and DP, respectively. The inhibition effect of 2-hydroxynaphthalene was best. Its EC50 was 33.577 1mg/L, EC90 was 122.3162 mg/L, and control effect was 48.53%.Key words: pomegranate brown spot disease toxicity test
6、 control0 前言石榴亦称番石榴，是桃金娘科番石榴属的常绿灌木或小乔木。石榴全身是宝，含有帮助消化、增进食欲的石榴酸，还具有抑菌、抗病毒的作用，同时会使体内的寄生虫产生麻痹作用。石榴果实味甘、涩、性温，具有治疗急性胃肠炎、急慢性咽喉炎、声音嘶哑、痔疮疼痛、痢疾腹泻、小儿疳疾等医药用功能1。同时还含有丰富的果酸、单宁、果胶质、黄酮类及花色素等有巨大的营养保健作用的物质。所以，石榴能够成为馈赠亲友的佳品。褐斑病是石榴主要的病害之一2。在贮藏期间褐斑病会使石榴果皮呈现不规则的病斑，籽粒也会呈现淡绿色或红色颗粒状，果实的肉质由微酸甜变成清苦味，而且果实易腐烂，失去商业价值3,4。1 材料和方法1
7、.1 材料选用会理青皮软籽石榴为试验材料。1.2 试验方法1.2.1 PDA培养基的制备和灭菌马铃薯去皮，称取200g，煮至软烂，去浮沫，用纱布过滤，滤液中加入20g琼脂和20g葡萄糖，并迅速加热，搅拌混匀，待琼脂和葡萄糖完全溶解后，冷却，定容至1000mL，分装入三角瓶中，121灭菌20min，取出冷却后备用。1.2.2 分离纯化采用组织分离法5对病原菌进行分离。从石榴果表皮的病斑处取大小为3mm3mm的组织块若干，75酒精消毒5-10s，取出，用无菌水清洗3次，并用无菌滤纸吸干，将其接到PDA培养基上，26恒温培养，5d后挑取组织边缘长出的菌丝块转接到另一个PDA培养基上，此后再纯化3次，
8、得到的菌株保存在PDA斜面上，4下保存。1.2.3 病原菌的形态特征观察将分离纯化得到的病原菌进行活化后，26恒温培养，观察其菌落形态特征并记录。取出一小块，在1040倍显微镜下观察其形态特征，并记录。1.2.4 病原菌的科赫氏法则鉴定供试验的菌株26培养5d后，采用刺伤接种法将菌块接种到健康石榴果实上，将石榴果实用75%酒精进行表面消毒，然后用无菌水清洗3次，用灭菌的接种环针在果实表面刺孔，然后将直径约4mm的活化菌丝块接种于刺孔处，以接种空白培养基为对照，26保湿培养，定期观察发病情况。比较其发病症状与初次分离时的症状是否一致，并对接种成功的病斑进行组织分离，与接种的菌株相对比6。1.3
9、不同药剂对石榴果褐斑病的室内毒力测定1.3.1 供试药剂 试验选用20种食品添加剂7，见表1。表1 供试药剂商品名有效成分及含量药剂状态商品名有效成分及含量药剂状态艾玛斯特2.5%乳酸链球菌素白色粉末状KESHI99.5%2-萘酚粉白色片状傲阳98%脱氢乙酸钠白色粉末状KESHI99%乙二胺四乙酸二钠白色粉末状亿航化工聚赖氨酸淡黄色粉末状展云95%肉桂醛浅黄色油状绿茶萃取精华98%茶多酚红褐色粉末状焦亚硫酸钠97.5%焦亚硫酸钠白色晶体颗粒EKESR2,4-二氯苯氧乙酸白色粉末状圣效98.5%对羟基苯甲酸甲酯钠白色结晶颗粒尼泊金乙酯99%对羟基苯甲酸乙酯白色晶体状瑞林单辛酸甘油酯白色结晶固体奥
10、凯58%双乙酸钠白色晶体状梅丙酸钙白色粉末状银象50%纳他霉素灰色粉末状仲丁胺99%仲丁胺白色结晶粉末王龙98%山梨酸钾乳白色颗粒万年桥牌99.58%苯甲酸钠白色粉末状LUSEN99%对羟基苯甲酸乙酯钠白色粉末状秀霸36%二氧化氯消毒粉白色粉状1.3.2 室内毒力初筛测定方法采用生长速率法对石榴病害进行食品添加剂室内毒力测定8-10，试验选择20种食品添加剂进行初步筛选，试验使用的药剂见表1。根据食品添加剂使用标准将2-萘酚配制成含药浓度为2、20、200mg/L的3个浓度梯度，将其它食品添加剂分别按照各自的药品有效成分配制成含药培养基浓度为20、200、2000mg/L。取已配制好的溶液1m
11、L于培养皿中，迅速倒入9mL 50左右的PDA培养基，趁热摇匀，冷却，得到不同浓度含药培养基，每个处理3次重复，用无菌水作为对照。将直径约4mm的活化菌块接种到各培养基上，26恒温培养6，5d后，采用十字交叉法测量菌落直径(cm)，计算各种食品添加剂对石榴褐斑病原菌的抑制率，查生物统计机率值换算表得出机率值，初步筛选出抑制效果较好的几种添加剂。1.3.3室内毒力复筛测定方法将初筛选出来的6种食品添加剂配制成如表2所列浓度，以无菌水作为对照，方法同前。采用最小二乘法计算出各种食品添加剂的毒力回归方程12，然后进行相关性分析，求出EC50和EC90。表2 6种食品添加剂浓度配制药剂名称含药浓度（m
12、g/L）对羟基苯甲酸乙酯220501002005001000聚赖氨酸2205010020050010002-萘酚210204080100150脱氢乙酸钠20501001502005001000肉桂醛501001602004008001600对羟基苯甲酸乙酯钠5010016020040080016001.3.4 食品添加剂对石榴病害防治将筛选出来的食品添加剂按照各自的抑菌率为90%对应的浓度( EC90)进行配制，以清水为对照，对石榴果实浸泡3min，20个果实为1个处理，每个处理进行3次重复，在26、相对湿度为85%-90%的条件下贮藏，对各处理果实进行编号以便调查。在贮藏5d后对病害展开调查
13、，记录病害级别（见表3），计算出发病指数、发病率和防治效果11-14。 表3 病害级别表病害级别分级标准病害级别分级标准0级无病斑3级接种点坏死斑直径为1.0-2.0cm1级接种点坏死斑直径为0.5cm以下4级接种点坏死斑直径为2.0-4.0cm2级接种点坏死斑直径为0.5-1.0cm5级接种点坏死斑直径为4.0cm以上1.4 数据处理 用Excel做数据统计与作图处理，并对所得图、表分析和讨论。2 结果与分析2.1 病原菌形态学鉴定2.1.1 症状观察石榴果皮初期病变部位为浅褐色，呈不规则的病斑形状，并不断向四周扩散，后期颜色逐渐加深变为黑褐色，病健交界处明显，且向内凹陷15（见图1左）。2
14、.1.2 病原菌的培养性状及形态特征将褐斑病原菌接种到PDA培养基上，26恒温培养1d后，如图2观察可知，菌块周围长出白色气生菌丝10，然后又在平板表面逐渐呈近似圆形放射状扩展，培养5d后，菌落直径达到5.0-7.0cm（见图1中）。显微镜下观察，4-5d后形成黑色的分生孢子器，分生孢子器簇生，形状类似球形，呈淡褐色，大小为(123.0-145.0)(55.0-75.0)m；顶端具圆形孔口，大小为12.5-15.0m；分生孢子纺锤形，淡褐色，直或微弯，大小为(10-14.5)(2.5-3.5)m（见图1右）。 图1 石榴果果皮受害症状（左）、PDA培养基上的菌落形态（中）和石榴褐斑病病菌形态（右）2.1.3 病原菌科赫氏法则鉴定刺伤接种的石榴果发病症状特点与自然发病石榴果症状基本相同，从发病组织分离的病原菌与自然发病组织分离的病原菌为同一种。2.2 不同防腐剂对病原菌的室内毒力测定与分析2.2.1 不同食品添加剂
