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1、Western blot protocol步骤：1. 分离胶和积层胶，制胶板；注意：灌分离胶时不要加太多。2. 蛋白变性：准备蛋白样本，加入等体积的2上样Buffer稀释，置于沸水中煮10min（预染marker煮5min）3. 加样：每孔加入2040l样品4. 电泳：置于电泳槽中电泳45min，恒定电流90mA（2块板），如为1块板则电流为50mA；5. 取出胶板，用切割刀修好胶；6. 将胶置于转膜液中浸泡；7. 按顺序放好下列物质：黑面海绵滤纸胶NC膜滤纸（用吸管赶去气泡）海绵；8. 置于转膜槽中于，黑面对黑面，加上冰块，加入转膜液；9. 装好电极，于恒定电压100V下，90min；10.
2、 丽春红染膜；11. 用TBST洗去丽春红；12. 封闭：加入5脱脂奶粉TBST，常温摇床摇1h；13. 回收封闭液，加入一抗【一抗用5BSATBS稀释】；14. 置于4摇床摇过夜；15. 回收一抗，TBST洗膜，10min，共3次；16. 加入二抗【二抗用5脱脂奶粉TBS稀释】，常温摇床摇1h；17. 回收二抗，TBST洗膜，10min，共3次；18. 将膜置于发光液中浸泡约1min；19. 将膜铺于曝光盒中，于暗室中曝光，洗胶片。常用溶液配制： 细胞裂解液（PLC Lysis Buffer）Final concentration100ml500ml1M Hepes(pH7.5)50mM5m
3、l25ml5M NaCl150mM3ml15mlGlycerol10%10ml50ml50mM MgCl21.5mM3ml15mlTriton1001%1ml5ml0.5M EDTA(pH8.0)1mM200l1ml0.1M NaPPi10mM10ml50ml0.5M NaF10Mm2ml10ml每次提取蛋白前加入1蛋白酶抑制剂. SDS-PAGE胶配方及其它常用溶液的配制130%丙烯酰胺丙烯酰胺 29gN-N-亚甲双丙烯酰胺 1g溶于总体积为60ml的水中，加热至37使其溶解，补加水至终体积为100ml。用Nalgene滤器（0.45m孔径）过滤除菌或Whatman 1号滤纸过滤，查证该溶液
4、的pH值不大于7.0，置棕色瓶中保存于RT。 注：（1）丙烯酰胺是强烈的神经毒素，可经皮肤吸收，丙烯酰胺的作用具累积性。 （2）称取时，必须戴手套、口罩；取溶液时也要戴手套。 （3）贮存期间，丙烯酰胺和双丙烯酰胺缓慢转化为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨反应是光催化和碱催化的。应检查丙烯酰胺溶液的pH值是否在7.0或更低，并应在RT下避光保存。每隔数月应重新配制溶液。23M Tris-HCl,pH8.8（用于分离胶） Tris碱分子量为121.1。将72.66gTris碱溶于重蒸水（不超过200ml）中，加浓盐酸调节pH至8.8，让溶液泠却至RT，再最终调至所需pH值。加重蒸水定容至200ml，1.
5、034105 Pa，20min高压灭菌，RT贮存。 注：(1)如溶液呈现黄色，应予丢弃，并置备质量更好的Tris.(2)Tris溶液的pH值因温度而异，温度每升高1，pH值大约降低0.03个单位。32M Tris-HCl,pH6.8（用于积层胶） 同上方法，将48.44gTris碱加重蒸水定容至200ml，加浓盐酸调节pH至6.8。410%十二烷基硫酸钠（SDS） 在900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2，加水定容至1L，分装备用。 注：SDS的微细晶粒易于扩散，因此称量时要戴面罩，称量完毕后要清除残留在称量工作区和天平上的SDS，10%
6、SDS溶液无须灭菌。5TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺) TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。由于TEMED只能以游离碱的形式发挥作用，因此pH值较低时聚合反应受到抑制。610%过硫酸胺 过硫酸胺提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。可用去离子水配制小量10%（W/V）的贮存液于保存于4。由于过硫酸铵会缓慢分解，故应隔新鲜配制。 方法：把1gAPS溶解于终量为10ml水溶液中，4保存数周。7. 电泳缓冲液SDS buffer: 10X（running buffer）Tris base 30.3gGlycine 144.0gSDS 10.0gd
7、dH2O to 1L(1X conc: 25mM Tris base, 192mM glycine, 0.1%SDS,)8. 转膜缓冲液Transfer Buffer(10) pH8.3 Tris base 30.3g Glycine 144.0g20%v/v methanol (Fresh!)ddH2O to 1 L(1X conc: 25mM Tris base, 192mM glycine, 200ml methanol)9. TBST(10X) pH: 7.5Tris base 24.2gNaCl 80.0gTween-20 10 mlddH2O to 1L(1X conc: 100m
8、M Tris base, 150mM NaCl, 0.1%Tween20)10Tris缓冲盐溶液（1X TBS，25mmol/L Tris）NaCl 8.0gKCl 0.2gTris碱 3.0g溶解于800ml蒸馏水中，加入0.015酚红并用HCl调pH值至7.4，用蒸馏水定容至1L，分装后在15lbf/in2(1.034105 Pa)，高压下灭菌20min，RT贮存。11发光剂100mM Tris Base（pH8.5） 10 ml250mM Luminol (in DMSO) 50 l90mM P-Coumaric Acid (in DMSO) 22 l30%H2O2 2.75 lSDS-
9、PAGE Mini-Gel Recipes7%Running Gelgels24Acrylamide:bis-acrylamide (ml)483M Tris-HCL, pH 8.8 (ml)1.53.0ddH2O (ml)6.2812.5610%SDS (ul)12024010%APS (ul)100200TEMED (ul)61210%Running Gelgels2 4 Acrylamide:bis-acrylamide (ml)2.85.63M Tris-HCL, pH 8.8 (ml)1.5 3.0ddH2O (ml)7.48 14.9610%SDS (ul)12024010%APS
10、 (ul)100200TEMED (ul)61212%Running Gelgels24Acrylamide:bis-acrylamide (ml)4.89.63M Tris-HCL, pH 8.8 (ml)1.53.0ddH2O (ml)5.4810.9610%SDS (ul)12024010%APS (ul)100200TEMED (ul)61215%Running Gelgels24Acrylamide:bis-acrylamide (ml)6123M Tris-HCL, pH 8.8 (ml)1.53.0ddH2O (ml)4.288.56 10%SDS (ul)12024010%APS (ul)100200TEMED (ul)612Stacking Gelgels24Acrylamide:bis-acrylamide (ml)0.751.52M Tris-HCL, pH 6.8 (ul)375750ddH2O (ml)4.89.610%SDS (ul)6012010%APS (ul)150300TEMED (ul)36
