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1、实验室啤酒发酵一、实 验目的 ：熟悉静止培养操作，观察啤酒发酵过程，掌握发酵过程中一些指标的分析操 作技能。二、实 验原理 ：啤酒酵母将麦芽汁发酵，产生酒精等发酵产物.1O C -30 C可调生化培养箱。培养基： . 麦芽汁发酵培养基 10Plato,50 升，糖化制取。. 麦芽汁琼脂培养基：麦芽汁加 2琼脂，自然 pH 。 . 麦芽汁液体培养基：酵母扩大培养用。菌种 ：啤酒生产用酵母菌株。四、实验步骤 ：1 ）麦汁制备2）酵母菌种分离纯化与质量鉴定3）菌种扩大培养4）啤酒主发酵：麦汁 50升，10BX , 11Ct接种量1.5 X 107个细胞/mL宀主发酵， 11 C, 57天t至4.0B
2、X时结束 嫩啤酒）。在主发酵过程中，每天测定下列项目： 糖度、细胞浓度、出芽率、染色率、酸度、a -氨基氮、还原糖、酒精度、pH、双乙酰。然后以时间为横坐标，这些指标为纵坐标，叠画于方格纸上。5）后发酵五、作业要求1 ） . 画出发酵周期中上述上述指标的曲线图，并解释它们的变化。2 ） . 记下操作体会与注意点。实验一 协定法糖化实验一、实验目的：协定法糖化实验是欧洲啤酒酿造协会 EBC ）推荐的评价麦芽质量的标准方法，我们用该法进行小量麦芽汁制备，并借此评价所用麦芽的质量。二、实验原理： 利用麦芽所含的各种酶类将麦芽中的淀粉分解为可发酵性糖类，蛋白质分解 为氨基酸 具体参见理论部分第二节）
3、。三、实验器材和试剂：1 实验室糖化器：由水浴和 500600 mL 的烧杯组成糖化仪器，杯内用玻棒搅拌或用100 C温度计作搅拌器 此时搅拌应十分小心，以免敲碎水银头）。实验时杯内液面应始终 低于水浴液面。最好采用专用糖化器：该仪器有一水浴，水浴本身有电热器加热和机械搅拌 装置。水浴上有 48 个孔，每个孔内可放一糖化杯，糖化杯由紫铜或不锈钢制成，每一杯内 都带有搅拌器，转速为 80100 转/分，搅拌器的螺旋桨直径几乎与糖化杯同，但又不碰杯 壁，它离杯底距离只有 12 mm 。2 白色滴板或瓷板，玻棒或温度计。3 滤纸，漏斗，电炉。4 碘溶液， 0.02N ： 2.5 克碘和 5 克碘化钾
4、溶于水中，稀释到 1000 毫升。四、实验步骤1. 协定法糖化麦汁的制备1 ）取 50g 麦芽，用植物粉碎机将其粉碎。2 ）在已知重量的糖化杯 500600 mL 烧杯或专用金属杯）中，放入 50g 麦芽粉，加200mL 4647 C的水，于不断搅拌下在45C水浴中保温 30分钟。3）使醪液以每分钟升温 1 C的速度，升温加热水浴，在25分钟内升至70 C。此时于杯内加入100 mL 70 C的水。4） 70 C保温1小时后，在1015分钟内急速冷却到室温。 5）冲洗搅拌器。擦干糖化杯外壁，加水使其内容物准确称量为450g。6）用玻棒搅动糖化醪 ，并注于干漏斗中进行过滤，漏斗内装有直径 20
5、厘 M 的折叠 滤纸，滤纸的边沿不得超出漏斗的上沿。7）收集约 100mL 滤液后，将滤液返回重滤。过 30 分钟后，为加速过滤可用一玻棒 稍稍搅碎麦槽层。将整个滤液收集于一干烧杯中。在进行各项实验前，需将滤液搅匀。2. 糖化时间的测定 在协定法糖化过程中，糖化醪温度达70 C时记录时间，5分钟后用玻棒或温度计取麦芽汁 1 滴，置于白滴板 或瓷板）上，再加碘液 1 滴，混合，观察颜色变化。 每隔 5 分钟重复上述操作，直至碘液呈黄色不变色）为止，记录此时间。由糖化醪温度达到70 C开始至糖化完全无淀粉反应时止，所需时间为糖化时间。报告以每 5 分钟计算：如 的比例达1： 2.5以上。麦皮在麦汁
6、过滤时形成自然过滤层，因而要求破而不碎。如果麦皮粉碎过细，不但会造成麦汁过滤困难，而且麦皮中的多 酚、色素等溶出量增加，会影响啤酒的色泽和口味。但麦皮粉碎过粗，难以形成致密的过滤 层，会影响麦汁浊度和得率。麦芽胚乳是浸出物的主要部分，应粉碎得细些。为了使麦皮破而不碎，最好稍加回潮后进行粉碎。六、思考题：糖化过程中麦芽中各种酶的作用。实验二啤酒酵母纯种分离一、实验目的：学习酵母菌种的纯种分离技术二、实验原理：关于纯种分离，在基础微生物学实验中已学过稀释分离法和划线分离法，这 里不再重复。这两种方法虽然简单，但并不能保证分离所得种的纯度。而单细胞分离法因可 用显微镜直接检查，其纯度能得到充分保证。
7、林德奈单细胞分离法，即小滴培养法，是将酵母菌液充分稀释至每一小滴差不多含一个酵 母细胞，然后在显微镜下确证只含一个细胞的小滴，经适当培养后，扩大保存。盖玻片上小滴点样示意图凹载片上湿室小滴培养适宜图三、实验器材与试剂：显微镜，凹载玻片，计数板，盖玻片等。四、实验步骤：1. 取2块盖玻片，用分析天平称重 精确至0.1mg ）后，在一块盖玻片 最好用血球计数板的盖玻片）上用毛细滴管滴上9滴酵母培养基，合上另一玻片，再称重，计算每滴培养基的体积。2. 用计数板计数酵母菌，用培养基对其进行高倍稀释，稀释至每滴培养基中大致含一个酵 母菌。3. 在已灭菌的盖玻片上滴上酵母稀释液每张玻片可滴 9 滴），放于
8、已灭菌的凹载玻片上，显微镜下观察，找到只含一个酵母菌的小滴，做上记号。4. 30 C培养一定时间后 应放于湿室中），用无菌滤纸片吸走标记的酵母菌，进行扩大培养和菌种保藏。五、注意事项 ：因小滴易干，操作时动作要快，培养时要用湿室。六、思考题 ：称重时为什么要用两块盖玻片？是否可以用微量移液器如 1 微升）来代替称重？实验三啤酒酵母的计数一、实验目的 ：学习用血球计数板计数酵母数量的方法，二、实验原理 ：啤酒发酵时，必须接入一定数量的酵母细胞；在发酵过程中，为了跟踪发酵的进程，判断发酵是否正常，也有必要测定悬浮酵母细胞的浓度。酵母菌的计数常用血球 计数板方法。血球计数板是一块长方形的玻璃板，被四
9、条凹槽分隔成三个部分，中间部分又 被一横槽隔成上下两半，每一半上各刻有一个方格网，方格网的边长为3mm, 分为 9 个正方形大格，每一大格为 1mm2,其中中间那个大格被横向和纵向的双线分成25或16 ）个中格，每个中格又被单线分成 16或25）个小格，因此一个大格中共有25X 16=400个小格。这样的一个大格就是一个计数室。因为计数室比板表面要低0.1mm, 因此盖上盖玻片后，整个计数室的容积就是 0.1 mm3,相当于0.0001mL。计数时，先让计数室中充满待检溶液，然后计数 400个小格中的细胞总数，就可换算出1mL 发酵液中的总菌数。三、实验器材 ：显微镜，血球计数板，盖玻片等。四
10、、实验步骤：1. 取清洁的血球计数板一块，平放于桌面上，在计数室上方加盖专用盖玻片；2. 取酵母菌液 发酵液）一小滴，滴至盖玻片的边缘，让菌液渗入计数室内，注意计数室内 不能留有气泡。3. 静置 5 分钟，让酵母细胞稳定附着于计数室内；4. 将计数板置于显微镜的载物台上，先用低倍镜找到计数板的方格网，并移至视野中间寻找时可通过缩小光圈，降低聚光镜，开低电源电压等方式减少进光量，使视野稍偏暗）；5. 找到计数室位置 中间一个大方格），并看清由双线包围的中方格16 或 25格）及由单线包围的小方格 共 400 格）；6. 计数大格内的酵母细胞总数，必要时可在高倍镜下观察。若酵母细胞过多，可采取1
11、）：稀释后再计数； 2）：有代表性地选择左上，左下，右上，右下，中间五个中方格，计数其内的菌数，求得 每个中格的平均值，然后乘以中方格数 25 或 16），即得每个大格内的细胞总数；3 ） ：在上述 5 个中方格中选择处于顶角的 4 个小方格，计数，计算 20 个小方格中的总菌 数，再乘以 20，即得大格内的细胞总数。7. 计算：酵母细胞数/mL=大格中的细胞总数x 10000 X稀释倍数8. 血球计数板的清洗： 将血球计数板立即用流水冲洗干净，若菌液变干，酵母细胞被固定在计数板上，则很难用 流水冲洗干净，必须用优质脱脂棉湿润后轻轻擦洗，再用流水冲洗干净，凉干五、注意事项 ：1. 血球计数板的
12、计数室内刻度非常精细，清洗时切勿用试管刷或其它粗糙物品擦拭。2. 加样前，应先放好盖玻片，让菌液自然吸入。如果先加菌液，则因为盖玻片较轻，可能会浮在菌液上，这样，计数室内的容积就不再使0.0001mL 了。因此，为了使结果更加准确，最好不要用普通的盖玻片来替代。3. 计数时，为避免重复或遗漏，对压在方格线上的细胞，应遵循数上不数下，数左不数右的 原则 即凡压在上部或左面线上的细胞，都应计数入内，凡压在下部或右面线上的菌体，都 应忽略不计）。对出芽细胞，如果子细胞大于母细胞的一半，则应算作两个细胞。六、思考题 ： 计数时，发现计数板不干净，怎样快速地清洗计数板？实验三 啤酒酵母的质量检查一、实验
13、目的 ：学习酵母菌种的质量鉴定方法，二、实验原理 ：酵母的质量直接关系到啤酒的好坏。酵母活力强，发酵就旺盛；若酵母被污 染或发生变异，酿制的啤酒就会变味。因此，不论在酵母扩大培养过程中，还是在发酵过程 中，必须对酵母质量进行跟踪调查，以防产生不正常的发酵现象，必要时对酵母进行纯种分 离，对分离到的单菌落进行发酵性能的检查。三、实验器材与试剂 ：显微镜，恒温水浴，温箱，高压蒸汽灭菌锅，带刻度的锥形离心管等0. 025%美兰又称次甲基兰， Methylene blue ）水溶液： 0.025g 美兰溶于 100mL 水中；pH4.5的醋酸缓冲液：0.51g硫酸钙，0.68g硫酸钠，0.405g冰醋酸溶于100mL水中；醋酸钾 钠）培养基：葡萄糖 0.06% ，蛋白胨 0.25% ， 醋酸钾 钠） 0.5%，琼脂 2% ， pH 7.0。四、实验步骤：1. 显微形态检查 载玻片上放一小滴蒸馏水，挑酵母培养物少许，盖上盖玻片，在高倍镜下观察。优良健 壮的酵母菌，应形态整齐均匀，表面平滑，细胞质透明均一。年幼健壮的酵母细胞内部充满 细胞质；老熟的细胞出现液泡，呈灰色，折光性较强；
