成骨 成脂诱导

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1、间充质干细胞成骨及成脂诱导培养基标准制作 方法浏览：185更新：2013-07-01 11:12间充质干细胞培养细胞诱导分化时必然用到的就是培养液，配置出合适的培养液能够促 进细胞的分化，因此这一步操作时相当的关键。如何才能配置适合的诱导培养液呢济南 中赛生物来介绍成骨与成脂诱导培养液的配备方法。成骨诱导培养液配备与诱导操作：1准备含10%FBS的a-MEM培养液；2. 在备好的a-MEM培养液中添加50pM抗坏血酸,10mm&-磷酸甘油和100nm地塞米 松；3. 准备6孔培养板，将P4细胞按照5x103个/平方厘米的规格接种于原始a-MEM培养 液中；4. 待细胞长至基本融合后，更换上述制

2、备完成的成骨诱导培养液；5. 每三天换液一次，细胞长至7天时进行碱性磷酸酶染色；6. 二十八天后再进行矿化结节的茜素红染色。茜素红染色方法介绍:1. 去除细胞当前使用培养液，使用PBS清洗两次;2. 使用10%甲醛室温固定15分钟，完成后使用重蒸馏水冲洗两次；3. 按照1ml/孔加入40mM的茜素红染色液，室温孵育20min并轻微振荡；4. 清除掉没有完全结合的染料，用重蒸馏水漂洗并振荡5min重复4次；5. 倾斜放置2min，吸取多余的重蒸馏水；倒置显微镜观察拍照记录。成脂诱导培养液配备与诱导操作：1酒己置FBS10%含量的HG-DMEM培养液；2. 在配制完成的HG-DMEM培养液中加入卬

3、M地塞米松,10pg/ml胰岛素，200pM吲 哚美辛和0.5mM IBMX ；3. 准备6孔培养板，将P4细胞按照2x104个/平方厘米的规格接种于原始HG-DMEM 培养液中4. 待细胞长至基本融合后，更换上述制备完成的成脂诱导培养液培养2天，在用只含有 10pg/ml胰岛素的成脂维持培养液培养1天，如此交替循环培养至14天，使用红油O 染色。红油O染色方法介绍：1. 去除细胞使用的当前培养液，使用PBS清洗两次；3. 重蒸馏水清洗3此，空气中干燥;4. 加入的红油室温孵育一小时;5. 配制70%乙醇溶液清洗3次;6. 倒置显微镜观察拍照记录。丁香二、诱导成骨体系 1.试剂?溶剂?终浓度?

4、储存浓度?？1ml体系加量Dex? ?去离子水？uM?1mM?uLVc?PBS?50uM?50mM?1uL 8 -磷酸甘油？PBS?10mM?1M?10uL2. DMEM (HG)和 10%FBS。3. 3代以上细胞，24孔板每孔105个细胞，六孔板每孔6000个细胞，每三天半 量换液，共诱导2周。成骨诱导剂：地塞米松(1x10-8mol/L)，步甘油磷酸钠10mmol/L、维生素C50ng/ml，高糖DMEM ，青链霉素各100u/ml，体积分数10%的胎牛血清。成骨诱导培养基成分: 兔骨髓间质干细胞成骨诱导分化基础培养基175 mL兔骨髓间质干细胞培养专用胎牛血清20 mL谷氨酰胺2 mL

5、双抗2 mL抗坏血酸400 u L8一甘油磷酸钠2 mL地塞米松20 uL兔骨髓间质干细胞成脂诱导分化培养基A液兔骨髓间质干细胞成脂诱导分化基础培养基A175 mL兔骨髓间质干细胞培养专用胎牛血清20 mL谷氨酰胺2 mL双抗2 mL胰岛素400 uLIBMX （IBMX, 3-异丁基-1 -甲基黄嘌吟）200 uL罗格列酮（吲哚美辛）200 uL地塞米松200 uL兔骨髓间质干细胞成脂诱导分化培养基B液兔骨髓间质干细胞成脂诱导分化基础培养基B175 mL兔骨髓间质干细胞培养专用胎牛血清20 mL成脂诱导培养基成分:双抗2 mL谷氨酰胺2 mL胰岛素400 uL对成脂肪诱导要特别提醒你，用国产

6、血清比进口的效果更好（仍为10%浓度）。我用的是SIGMA的地塞米松（D1756 ）, 25mg包装的，248元贵的惊人！须用无水乙醇溶解。我也用过病房常用的5mg的地塞米松磷酸钠，效果也挺好的。首选的是dexamethasone-water soluble, cell culture tesoteil少可以配成1:1000的母液，使用起来很方便。使用医用制剂尤其要小心溶剂的问题，好些制剂不是融解在水里的，如果你没有设置合适的阴性对照，会给你的实验带来Bug o脂肪诱导培养液：DMEM,10 % FCS，10-6M地塞米松，100微克/ ml 1一甲基一 3 一异丁基一黄嘌吟，50微克/ ml

7、抗坏血酸。很难找到一套抗兔的抗体。油红染色的方法如下：脂肪油红染色（原位）：1. 称取0.5g油红干粉，溶于100mL异丙醇中，配成油红储存液，棕色瓶保存。2. 除去培养基用PBS洗涤1遍3.加10 %中性甲醛固定5min4. 稀释油红储存液，油红;去离子水= 3:2,滤纸过滤，室温放置10min （除去一些 杂质，染色结果更清晰）5. 染色30min，如果是培养皿或培养板，加的体积覆盖住板底即可。如6孔加， 24孔加。6. 显微镜观察，及时照相，时间过长，脂肪滴会自发破裂，到时就前功尽弃了， 几个星期的努力欧！这位大虾的油红染色方法基本正确，但有几个地方修改一下后效果会更好！第一，染色的时间减少到5-10分钟足够了，剩下更多一些拍照的时间。第二，为了使底色更加的清楚，可以用异丙醇洗涤一次。（染色前用60%的异丙 醇稍洗，染色后还要用60%的异丙醇脱色，是这样吗） 第三，洗涤后的细胞加PBS,可以延晚脂肪滴破裂。