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1、利用蚕豆根细胞微核技术检测洗发水的毒性09生物技术 宁伟 王晓刚 太红桥 刘经源摘 要 微核(micronucleus,MCN)是真核生物细胞经各种理化因 子作用后引起染色体畸变，在间期细胞中的一种表现形式。在细胞间 期,微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外,大小应在主核1/31/20, 染色与主核一样或稍浅。一般认为微核是由无着丝粒的染色体断片或 落后染色体,在分裂末期不能进入主核,便形成了主核之外的核块。 当子细胞进入下一次分裂间期时,它们便浓缩成主核之外的小核,即 微核。1蚕豆根尖细胞微核试验(Micronucleustest,MC-NT)技术是一种 以染色体断裂及纺锤丝损伤为测试终点的植
2、物微核检测方法。它是一 种应用于监测环境致突变物对人体和其他生物体的遗传物质产生危 害的技术,并从细胞遗传学水平上探讨植物遗传物质的改变状况与环 境污染,也可以检测淡水环境的质量。2 关键词 蚕豆根尖 微核 洗发水 千分率蚕豆是一种很好的细胞遗传学研究材料。它的染色体为六对相当 大的染色体,而且根尖含有较多的分裂相细胞,非常适合显微观察。 目前,蚕豆根尖微核技术在环境致突变性检测/监测方面已经形成了 一套完整的体系。它的可靠性和灵敏性较高,且本底较低,这对于一 种致突变性检测方法是十分重要的。此外,它的检测物谱较广。目前 多数学者认为,在镜检细胞微核时,应按下列标准计数微核：（1）凡主核大小1
3、/3 以下，与主核分离的小核；（2）小核的着色与主核相当或稍浅；（3）小核形态可为圆形，不规则等。31. 实验目的掌握蚕豆根尖细胞微核检测技术的一般方法。并利用蚕豆根尖细 胞微核检测技术对洗发水的毒性状况给出客观的评价，同时表明蚕豆 根尖细胞MCN对胁迫很敏感，蚕豆根尖微核技术可用于洗漱用品的安 全监测。2. 材料与方法2.1 实验材料蚕豆种子、洗发水、显微镜、镊子、培养皿、剪刀、载玻片、盖 玻片、烧杯、Carnoys固定液、盐酸酒精解离液、改良苯酚品红染液、 NaN3 等。2.2 毒液配制选取所测洗发水，按平时所用比例与水混合均匀。2.3 实验方法2.3.1 浸种择饱满、均匀的20粒种子，洗
4、净后用蒸馏水常规浸种24h，此期至少换水 2 次；待种子充分吸胀后，移入干净的培养皿内培养。2.3.2 催芽种子吸胀后，保持湿度，在室温下催芽2天。2.3.3 被检测液处理根尖各取10粒，分别用蒸馏水（自来水）和毒液培养种子1天。2.3.4 根尖细胞恢复培养处理后的种子用蒸馄水（自来水）浸洗3次，每次23 min； 将处理液洗净后，置于干净培养皿恢复2224h ；同时均设蒸馄水处 理为空白对照组。以上各步操作温度均在25C下进行。2.3.5 根尖细胞固定将恢复后的种子，从根尖顶端切下1 cm左右长的幼根，用卡诺氏液固定56h。2.3.6 酸解用蒸馄水浸洗固定好的幼根3次，每次5min，吸净蒸馄
5、水，加 入盐酸酒精解离液60C下酸解68min，幼根软化即可。2.3.7染色吸去盐酸，用蒸馏水浸没幼根3次，每次12分钟。最后浸于 水中。制片前取出置载玻片上，截下12mm左右长的根尖，滴1-2 滴改良苯酚品红染液染色20min,之后方可压片观察。2.3.8 压片观察对各种不同处理的根尖分生组织进行常规压片，每个处理各取3 个根尖压片。在高倍镜下观察压片根尖分生区细胞分散良好的区域， 并统计不少于1000个细胞中的微核数，然后再统计算出每个根尖的 MCN%。3. 结果3.1标准规定5对于蚕豆微核实验中微核千分率的计算可采用以下公式：MCN%。二某测试样点（或对照组）观察到的MCN数/某测试样点
6、（或 对照组）观察到的细胞数X1000%。对于污染指数（PI）的计算可采用以下公式：PI=实验组MSN%。总数/对照组MSN%。总数污染指数（PI）判断如果采用市售蚕豆种子，按规范操作标准实验条件（其对照本底 为10%以下），其监测样品污染程度的划分可采用“污染指数（PI） ” 判断。根据全国生物技术监测规范蚕豆根尖微核技术规定的污染 指数划分标准，采用污染指数（PI）值来划分受污染程度。此方法可 避免因实验条件等因素带来的MCN%。本底的波动，标准见表1。凡数 值在上、下限时定为上一级污染。表1污染指数PI值评价洗发水标准表污染指数PI值样品污染等级0 1.5基本无污染1.5 2.0轻污染2
7、.0 3.5中污染3.5以上重污染3.2结果在对照组和实验组中均可见到一定数量的微核，也发现少量有丝 分裂期微核，各种染色体畸变等。根据镜检统计结果，对3 个实验组 玻片以及对照组（蒸馏水）共计4个样本的MCN%。进行统计（表2）。表 2 洗发水安全指数MCN%总数PI污染指数对照组2.11 (1.42, 1.46, 3.45)一4.37 (3.52, 3.73, 5.86)2.07中污染二5.13 (4.51, 4.71, 6.17)2.43中污染三4.42 (3.57, 4.57, 5.12)2.09中污染结论：各样品MCN%差异不大，但都和对照组相比差异较显著,表明洗发水存在一定致突变性
8、，且对人体有危害，但不是很大。4. 讨论从以上的实验结果及分析可看到，洗发水使蚕豆根尖细胞产生微 核。微核试验是一种以染色体断裂及纺缍丝损伤等为测试终点的植 物微核监测方法，是监测致突变性污染的一种经济快速方法。致突变 性和致癌高度相关, 致突变污染物中可能存在致癌危险物。通过实验 表明，洗发水也具有一定的致癌性。实验证明，微核试验作为一种监测方法，是非常行之有效的。5. 结语微核技术作为一种新兴的生物科学短期测试方法，正在展示着 强大的生命力。当然，蚕豆微核技术只适于测试潜在的染色体损伤因 子，其获得的信息外推致突变物时任有一定的局限性。致突变物对蚕 豆作用的机制在分子和超显微结构水平上还缺
9、乏知识，以及在不同条 件下出现的差异，材料选择，方法应用方面，都还有待进一步深入研 究，统一认识。只有逐步做到规范化、标准化、微量化之后，才能更 有效地发挥微核技术的优越性。7参考文献1 陈光荣，金波，李明等.蚕豆根尖微核技术.见：环境监测技术规范第四册生物（水环境部分）。国家环保局，1986,7578.2 金波、欧光鉴等，蚕豆根尖微核试验敏感品种的筛选.华中 师范学院学报（自然科学版），1984，（2）：101108.3 陈光荣、金波、李明等.污染指数在微核技术监测水质污染中的应用.中国环境科学，1986，6（2）：6063.4 陈光荣、金波、李明等.蚕豆叶尖细胞威吓测定（MCNT）及 其监测大气污染的研究.中国环境科学，1988，6（2）：38.5 陈光荣、金波、李明等.蚕豆细胞微核技术监测农业土壤污 染的研究.环境科学，1988，13（2）：7477.6 王永兴等.应用蚕豆根尖细胞微核技术监测太湖水质的研究.中国环境科学，1997，17（3）：252.7 希媛媛.蚕豆根尖细胞微核技术监测黄河兰州段水质污染的 研究.甘肃联合大学学报，2005，19（3）：51
