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1、霍乱弧菌实验室检测SOP手册1. 标本的采集和送检1.1. 标本的采集：采集标本的好坏，对检验工作的质量影响很大。为尽快获得细检查结果，应在发病早期、在服用抗菌药物之前尽快采集标本和及时送到检验室。标本以病人大便为主。采便方法用灭菌的棉拭采集排出的新鲜大便，亦可用直肠棉拭或用采便管由肛门插入35采集。一般要求水样便采集1ml3ml，固形便采取蚕豆大小粪量。有时病人的呕吐物、沾染大便的衣物和尸体的肠内容物亦可作为检材。带菌者的大便可用棉拭或直肠棉拭采取。1.2. 标本的送检：采取的标本应立即接种培养基，典型病人的水样便含有大量病菌（106/ml109/ml），可直接做分离培养并同时增菌培养。不需
2、做直接分离的均可接种碱性蛋白胨水增菌。并立即送检验室。1.3. 标本运送途中较远，也可将标本放入文腊氏保存液或卡里布莱尔运送培养基。标本与保存液的比例为8ml10ml保存液加1ml3ml水样便或蚕豆大的固形便。也可用厚吸墨纸条吸饱水样便放入小塑料袋内封好送检。送检标本时，必须认真填写送检单，标本必须妥善包装，专人送检，并防止污染，注意安全，送检箱用后要严密消毒。2. 检验方法2.1. 培养方法2.1.1. 增菌培养：所有标本都应经过增菌，尤其是恢复期病人、带菌者或用过抗生素的病人标本，需增菌后再分离。碱胨水接种后放3768小时，夏日可将运送时间计算在内。保存液内的标本取1ml种入碱胨水中。培养
3、后慢慢地从碱胨水生长的菌膜下，取一接种环表层培养物接种于4号或庆大霉素琼脂平板。标本含菌少时，可实行二次增菌。取第一次碱胨水增菌后的表层液0.10.2ml，接种于另一碱胨水中，3768小时再做分离。2.1.2. 分离培养：急性典型病人标本在增菌的同时直接做分离培养，这样既可缩短检出的时间，还可避免标本中如有不凝集弧菌经增菌后大量繁殖，影响霍乱弧菌的分离。其它标本均应增菌后再做分离培养。当前的习惯多为碱性蛋白胨水增菌，再用强选择性培养基分离，371216小时长出的菌落，可供做玻片凝集用。2.2. 血清凝集：选择生长16小时的圆形、扁平、光滑、湿润、半透明、稍隆起、略带青灰色或中心变黑的菌落、如在
4、TCBS琼脂上为黄色菌落35个与霍乱O1群多价血清做玻片凝集试验。30秒内出现肉眼可见的明显凝集为阳性。凝集的菌落应以生理盐水排除自凝并用单价血清分型。对菌落典型O1群血清不凝者，可用O139群霍乱血清做凝集试验，有阳性者要立即报告。在流行后期可能出现O1群粗糙型，应该用粗糙型血清做凝集试验。已凝集的菌落应及时转种普通琼脂斜面或半固体琼脂，以备进一步鉴定和保留菌种。对现有霍乱诊断血清不凝集的，凡粘丝试验或氧化酶试验阳性，确定为弧菌者，亦可保留菌种上送。血清分型：方法是用小川型和稻叶型单价血清作玻片凝集试验。凡与小川型血清凝集，与稻叶型血清不凝集者为小川型；反之为稻叶型，在两个单价血清中都有明显
5、凝集者为彦岛型。应注意小川型菌株型有时在稻叶型单价血清中出现弱凝集，不要误认为是彦岛型。必要时应以两个单价血清的试管凝集滴度确定彦岛型。试管凝集试验：将霍乱多价诊断血清用生理盐水自1:20起倍比稀释，每管含稀释血清0.25ml。然后将被检菌的1624小时普通琼脂培养物，制成0.2%福尔马林生理盐水悬液，每毫升含20亿菌体，各血清稀释管均加入0.25ml。摇匀，置373小时观察初步结果，再放室温过夜，观察最后结果。通常以肉眼明显看出凝集（+）的血清最高稀释倍数为凝集滴度，生理盐水对照不应有自凝。2.3. 形态学检查：按常法涂片进行革兰氏染色，霍乱弧菌均为革兰氏阴性弧菌。用悬滴或暗视野检查动力呈穿
6、梭状。用半固体琼脂穿刺培养基检查动力，371620小时霍乱弧菌沿穿刺线扩散生长，为动力阳性。急性典型病人米泔样大便的絮片压片，干燥后甲醇固定，用1:10稀释石炭酸复红染色，可见弧菌呈鱼群状排列。2.4. 生化学检查：将被检菌的纯培养接种入葡萄糖、甘露糖、蔗糖、阿拉伯糖发酵管、蛋白胨水和硝酸盐胨水管中。2.5. 鉴定标准和诊断报告：霍乱弧菌以血清学鉴定为主，结合菌落特征、形态学和生化性状做出判定。凡具备弧菌菌落特征，与O1群霍乱多价血清玻片凝集阳性，并可用单价血清分型，即可判定。首发病例可以辅以粘丝试验和氧化酶试验，必要时再做其它试验。进一步鉴定O1群霍乱弧菌，还要做古典型和埃尔托型的鉴别及噬菌
7、体型的鉴别。O1群霍乱弧菌的检验报告要求迅速准确，基层单位在收到检验标本后应按疑似病人、 带菌调查、外环境标本分别登记编号，并迅速放入温箱培养。一般上午收到标本，下午下班前可做分离培养，次日上午可报告结果。典型病人水样便，增菌同时做直接分离，可提前报告结果，首例病人菌株需送上一级实验室鉴定和复核。首例病人确诊后再检出的菌株，经血清凝集结合菌落形态即可确诊。2.6. 菌株的保存：对所检获的阳性菌种或可疑菌种，均应接种半固体培养基，37过夜培养，用胶塞或石蜡封口，室温保存，切勿放入冰箱，因霍乱弧菌8以下易死亡。同时填写菌种保存单，逐级上送，做进一步鉴定。3. 快速诊断：由于霍乱弧菌的诊断以血清学为
8、主，因此各种快速诊断方法，无不以血清学为基础。目前常用的有制动试验、早期片凝、荧光菌球法和SPA协同凝集试验等方法，尚有免疫增凝、免疫检菌、免疫皂土、反向炭凝等方法。3.1. 制动试验：取急性典型病人的水样便或增菌液1滴（含大量弧菌）于玻璃片上，暗视野（也可直接镜检）检查可见有流星状运动之细菌，当加入1滴霍乱免疫血清后，运动停止，凝集成块。根据这种特殊动力和制动试验，可在几分钟内做出初步诊断。所用免疫血清要不加防腐剂的。使用血清效价为1:64，如原效价为1:1280的血清，1:20稀释使用。本试验的阳性率为50%85%。以培养出霍乱弧菌为确诊。3.2. 早期片凝法：埃尔托型弧菌在庆大霉素琼脂上
9、生长较快，37培养10小时左右，即可长出直径1mm左右菌落，取菌落或湿润菌苔直接做霍乱多价血清玻片凝集，阳性者可初步报告，平皿继续培养复查。3.3. 免疫荧光菌球法：将水样便或增菌培养物接种于有霍乱荧光抗体的蛋白胨水中，37培养46小时，涂片在荧光显微镜下观察，出现一定形态结构的荧光菌球者为阳性，并取菌球做细菌分离，本法适于大量标本初筛。3.4. SPA协同凝集反应：以金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）为载体，结合特异的霍乱免疫血清，制成霍乱SPA诊断液。方法是取SPA诊断液一滴于玻片上，加被检标本悬液或胨水增菌液一滴（同时做不加标本和未致敏SPA加标本对照），混匀，摇动玻片3分钟观察结果，凝集者记+、+、+、+、-，以+以上为阳性。若发现有非特异凝集，可将标本煮沸后再做协同凝集，以除去非特异性。本法快诊简便，但每毫升标本中必须含有细菌100个以上，才能出现阳性。阳性者取凝集块做分离培养，以检出霍乱弧菌为确诊。卫辉市卫生防疫站2006年7月1日
