《T_CITS 0012-2023 牛乳基婴幼儿配方乳粉及牛乳中A1和A2β-酪蛋白的测定 液相色谱-串联质谱法.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《T_CITS 0012-2023 牛乳基婴幼儿配方乳粉及牛乳中A1和A2β-酪蛋白的测定 液相色谱-串联质谱法.docx（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、ICS67.100.99CCSX16团体标准T/CITS00122023牛乳基婴幼儿配方乳粉及牛乳中A1和A2-酪蛋白的测定液相色谱-串联质谱法DeterminationofAlandA2-caseininbovineinfantformulaandmilkLC-MS/MSmethod2023-07-06发布2023-08-01实施中国检验检测学会发布T/CITS00122022前言本文件按照GB/T1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国检验检测学会提出并归口。本文件起草
2、单位：雀巢食品安全研究院、中国海关科学技术研究中心、青岛海关技术中心、上海海关动植物与食品检验检疫技术中心。本文件主要起草人：鲍蕾、冯鑫、张鸿伟、吕佳、汪龙飞、张晓梅、王金花、韩深、古淑青、梁成珠。T/CITS00122022牛乳基婴幼儿配方乳粉及牛乳中A1和A2-酪蛋白的测定液相色谱-串联质谱法1范围本规程规定了牛乳基婴幼儿配方乳粉和牛乳中A1-酪蛋白(Al-Casein)、A2-酪蛋白(A2-Casin)的测定方法。本规程适用于牛乳基的婴幼儿配方乳粉和液态乳中A1-酪蛋白、A2-酪蛋白含量的测定。不适用于发酵乳制品和含水解或酶解酪蛋白产品。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少
3、的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。3术语和定义下列术语和定义适用于本文本。3.1A1-酪蛋白是-酪蛋白的一种变异体，其一级氨基酸序列中第67号位氨基酸为组氨酸。3.2A2-酪蛋白是-酪蛋白的一种变异体，其一级氨基酸序列中第67号位氨基酸为脯氨酸。4方法原理试样中的牛-酪蛋白经尿素提取，二硫苏糖醇还原，碘乙酰胺烷基化，经胰蛋白酶酶解为肽段，经液相色谱-三重四级杆质谱测定，同位素内标法定量。5试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定
4、的一级水。5.1试剂5.1.1碳酸氢钠(NaHCO3)。5.1.2碳酸氢铵(NH4HCO3)。5.1.3二硫苏糖醇(C4H10O2S2，DTT)。5.1.4碘代乙酰胺(ICH2CONH2，IAA)。T/CITS001220225.1.5尿素。5.1.6乙酸(CH3COOH)。5.1.7甲酸(HCOOH):色谱纯。5.1.8乙腈(CH3CN):色谱纯。5.1.9碱性胰蛋白酶:活力大于10000BAEE每毫克蛋白质。5.1.10牛-酪蛋白标准品：纯度须准确标定，或经国家认证的标准物质。须依照附录A方法对牛-酪蛋白标准品中A1-酪蛋白及A2-酪蛋白含量进行测定。5.1.11牛A1-酪蛋白特异肽标准品
5、(序列:IHPFAQTQSLVYPFPGPIHNSLPQNIPPLTQTPVVVPPFLQPEVMGVSK)，纯度不低于90%。5.1.12牛A1-酪蛋白同位素标记特异肽标准品(序列:IHPFAQTQS(L*)VYPFPGPIHNS(L*)PQNIPP(L*)TQTPVVVPPF(L*)QPEVMGVSK)，纯度不低于90%。5.1.13牛A2-酪蛋白特异肽标准品（序列:IHPFAQTQSLVYPFPGPIPNSLPQNIPPLTQTPVVVPPFLQPEVMGVSK)，纯度不低于90%。5.1.14牛A2-酪蛋白同位素标记特异肽标准品(序列:IHPFAQTQS(L*)VYPFPGPIPNS(
6、L*)PQNIPP(L*)TQTPVVVPPF(L*)QPEVMGVSK)，纯度不低于90%。注：L*为同位素标记的亮氨酸(Leu-OH-13C6,15N7)。5.2试剂配制5.2.1碳酸氢钠溶液(100mmol/L)：称取4.20g碳酸氢钠，用水溶解后定容至500mL。5.2.2碳酸氢铵溶液(50mmol/L)：称取3.95g碳酸氢铵，用水溶解后定容至1L。5.2.3碳酸氢铵溶液(500mmol/L)：称取39.5g碳酸氢铵，用水溶解后定容至1L。5.2.4二硫苏糖醇溶液(500mmol/L)：称取0.771g二硫苏糖醇，用50mmol/l的碳酸氢铵溶液溶解后定容至10mL。(烷基化实验时使
7、用)5.2.5碘代乙酰胺溶液(500mmol/L)：称取0.925g碘代乙酰胺，用500mmol/L的碳酸氢铵溶液溶解后定容至10mL。(烷基化实验时使用)5.2.6乙酸溶液(1%，V/V)：移取0.1mL乙酸，用水稀释并定容至10mL。5.2.7碱性胰蛋白酶溶液(1mg/mL)：称取10mg碱性胰蛋白酶，用1%乙酸溶液溶解后定容至10mL。5.2.8甲酸水溶液(0.1%，V/V)：吸取1mL甲酸，用水稀释并定容至1000mL。5.2.9甲酸乙腈溶液(0.1%，V/V)：吸取1mL甲酸，用乙腈稀释并定容至1000mL。5.2.10尿素(6mol/L)：称取180g尿素，加水溶解定容至500mL
8、。5.3标准溶液配制5.3.1牛-酪蛋白储备液(2mg/mL)：准确称取牛-酪蛋白标准品20mg(精确至0.01mg)牛A1-酪蛋白特异肽标准品，用水溶解后定容至10mL。将溶液转移到塑料瓶中，置于-20冰箱内，可保存使用6个月。分装保存，避免反复冻融。5.3.2牛A1-酪蛋白特异肽标准储备溶液(500g/mL)：准确称取5.00mg(精确至0.01mg)牛A1-酪蛋白特异肽标准品，用水溶解后定容至10mL。将溶液转移到塑料瓶中，置于-20冰箱内，可保存使用6个月。分装保存，避免反复冻融。本储备液用于色谱及质谱条件建立。5.3.3牛A1-酪蛋白同位素标记特异肽标准储备溶液(500g/mL)：准
9、确称取5.00mg(精确至0.01mg)A1-酪蛋白同位素标记特异肽标准品，用水溶解后定容至10mL。将溶液转移到塑料瓶中，于-20冰箱内，可保存使用6个月。分装保存，避免反复冻融。T/CITS001220225.3.4牛A2-酪蛋白特异肽标准储备溶液(500g/mL)：准确称取5.00mg(精确至0.01mg)牛A2-酪蛋白特异肽标准品，用水溶解后定容至10mL。将溶液转移到塑料瓶中，置于-20冰箱内，可保存使用6个月。分装保存，避免反复冻融。本储备液用于色谱及质谱条件建立。5.3.5牛A2-酪蛋白同位素标记特异肽标准储备溶液(500g/mL)：准确称取5.00mg(精确至0.01mg)牛A
10、2-酪蛋白同位素标记特异肽标准品，用水溶解后定容至10mL。将溶液转移到塑料瓶中，置于-20冰箱内，可保存6个月。分装保存，避免反复冻融。、5.3.6同位素标记特异肽混合中间溶液(50g/mL)：准确吸取1mL的牛A1-酪蛋白同位素标记特异肽标准储备溶液，1mL的牛A2-酪蛋白同位素标记特异肽标准储备溶液，用水稀释并定容至10mL。置于-20冰箱内，可保存使用1个月。分装保存，避免反复冻融。5.3.7标准工作液的配制：分别吸取0L、10L、25L、50L、250L、500L、1mL-酪蛋白储备液，用水定容至1mL，配成浓度为0mg/mL0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、
11、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL的-酪蛋白工作液，将-酪蛋白标准工作液各浓度乘以附录A中求得的A1-酪蛋白及A2-酪蛋白占比，得到两种-酪蛋白的标准工作液浓度。临用前配制。6设备和材料6.1高效液相色谱串联质谱仪：电喷雾离子源。6.2天平:感量0.01g，0.01mg。6.3涡旋混合器。6.4超声波振荡器。6.5恒温水浴摇床。6.6微孔滤膜:0.22m。7分析步骤7.1试样制备7.1.1液态奶:称取1g(精确至0.01g)试样，用6mol/L尿素定容至25mL。7.1.2乳粉:称取1g(精确至0.01g)试样，用6mol/L尿素定容至100mL，超声溶解。7.2试样烷基化与酶解吸取
12、100L试样溶液，加入50L同位素标记特异肽混合中间溶液，780L碳酸氢钠溶液和10L二硫苏糖醇溶液，涡旋混匀，70恒温反应30min。取出冷却至室温，加入30L碘代乙酰胺溶液，涡旋混匀，暗处静置30min后加入20L碱性胰蛋白酶溶液，涡旋混匀，于370.5恒温酶解6h后冷却至室温，取出加入10L甲酸混匀，室温静置30min，过0.22m滤膜于进样瓶中，供高效液相色谱-串联质谱仪检测。7.3标准样品烷基化与酶解吸取5.3.7中各浓度标准工作液100L。分别为加入50L同位素标记特异肽混合中间溶液，100L的尿素溶液，680L碳酸氢钠溶液和10L二硫苏糖醇溶液,涡旋混匀，70恒温反应30min。
13、取出冷却至室温，加入30L碘代乙酰胺溶液，涡旋混匀，暗处静置30min后加入20L碱性胰蛋白酶溶液，涡旋混匀，于370.5恒温酶解6h后冷却至室温，加入10L甲酸混匀，室温静置30min，过0.22m滤膜于进样瓶中，供高效液相色谱-串联质谱仪检测。时间/min流动相A/%流动相B/%09551.09555.060405.501007.001007.595510.0955T/CITS001220227.4仪器参考条件7.4.1液相色谱参考条件7.4.1.1色谱柱：硅烷基C18柱，柱长100mm，内径2.1mm，粒径1.7m，孔径30nm(300)或等效者。7.4.1.2流动相：流动相A：0.1%甲酸水溶液；流动相B：0.1%甲酸乙腈溶液。7.4.1.3梯度洗脱：参考洗脱梯度参见表1。7.4.1.4流速：0.3mL/min。7.4.1.5柱温：40。7.4.1.6进样体积：10L。表1梯度洗脱程序7.4.2质谱参考条件7.4.2.1离子源：电喷雾离子源（ESI+）。7.4.2.2检测方式：多反应监测（MRM）。7.4.2.3扫描方式：正离子模式扫描。7.4.
