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1、Real-time PCR实验注意事项实验中的一些好习惯加入试剂之前,把它混匀一下,以免放置时间长了浓度不均移液枪用完之后要归到最大计量的位置,防止久而久之弹簧失去弹性一定要记着关水浴箱,切记切记多和大家讨论,同时多关注别人讨论的经验,这几乎是最快提高的捷径了所有的试剂都自己配,出了问题才好找原因防止RNA酶污染的措施1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180的高温下干烤6hr或更长时间。2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用)。3. 有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3% H2O2 室温10min,
2、然后用0.1% DEPC水冲洗,晾干。4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC,在37处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制,然后经0.22m滤膜过滤除菌。5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。6. 设置RNA操作专用实验室,所有器械等应为专用。二、常用的RNA酶抑制剂1. 焦磷酸二乙酯(DEPC):是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。2. 异硫氰酸胍:目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使RNA酶失
3、活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用。3. 氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性。4. RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin):从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合,使其失活。5. 其它:SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。因为DEPc不加选择的修饰蛋白质和RNA,因此在分离和纯化RNA过程中不能使用,而且它与一些缓冲液(例如Tri)不能相容在所有RNA实验中,最关键的因素是分离得到全长的RNA。
4、而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。研究人员造成的污染 RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此进行RNA实验时应勤换手套。但DEPC能与胺和巯基反应,因而 含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理(一)动植物总RNA提取-Trizol法 Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌,样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。 RNA可直接用于Northern斑点分析,斑点杂交, Poly(A)+分离,体外翻译,RNase封阻分析和分子克隆。1、将组织在液N中磨成粉末
5、后,再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。 2、研磨液室温放置5分钟,然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒。 3、取上层水相于一新的离心管,按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,室温放置10分钟,12000g离心10分钟。 4、弃去上清液,按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,涡旋混匀,4下7500g离心5分钟。5、小心弃去上清液,然后室温或真空干燥5-10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中
6、,必要时可55-60水溶 10分钟。RNA可进行mRNA分离,或贮存于70%乙醇并保存于-70。注意 1、整个操作要带口罩及一次性手套,并尽可能在低温下操作。另外,提取上清这步一定要小心,靠近沉淀的部分一定要舍得不要,要不然会有蛋白质污染,影响比值2、加氯仿前的匀浆液可在-70保存一个月以上,RNA沉淀在70%乙醇中可在4保存一周,-20保存一年。总mRNA的提取(自己的经验)一、关于Trizol Reagent需要的试剂1Chloroform:氯仿 (分析纯)2Isoproplyl alcohol:异丙醇(分析纯)375% Ethanol(in DEPC-treated water):75%
7、乙醇。要求用分析纯无水乙醇并用0.01%的DEPC处理过的无Rnase的水稀释。4RNase-free water:无Rnase的水。方法是:将DEPC按0.01%(V/V)加在d H2O中500ml(50ul),在37过夜,并高压灭菌即得(150 3小时)5一次性塑料手套6注意:DEPC有致癌之嫌二、关于Trizol Reagent的使用过程:1Homogenization(匀浆)a.Tissues:组织每100mg组织匀浆加1mlTrizol试剂,样品体积不能超过Trizol试剂的10%。b.Cells Grown in monolayer(单层细胞接毒后出现病变的)针对JEV细胞总RNA
8、的抽提法:BHK21细胞长成单层后,接毒0.5-1ml(采用大瓶),37吸附1h,倒掉,加维持液(含2%的血清和HEPE8的MEM)约5ml,维持天。出 现75%-100%的病变时,以PBS(预冷)冲洗细胞两次,直接在细胞瓶中加入Trizol试剂1ml/10cm2,吹吸几次,以裂解细胞(细胞瓶有两 种常用规格:大的约45cm2,小的约30cm2,故所用Trizol试剂分别约为4.5ml和3ml。Trizol试剂的加入是依细胞瓶而定,以盖满瓶 底为度,而不是依据细胞的数量,否则可导致DNA的污染)具体方法如下:(样品一定要新鲜)(1)组织接入预冷的EP管中,加入Trizol试剂1ml/10cm2
9、(量一定要加足,否则易污染),混匀,吹吸几次,以破裂细胞,置室温5min,以使核蛋白复合物彻底分离。(2)加氯仿0.2ml(每1ml Trizol试剂加入氯仿0.2ml),盖好,剧烈震荡15s,置室温2-3分钟。(3)4离心,10000g15min,离心后,混合物将分离为底层为浅红的、中层为酚-氯仿相、上层为无色的水相。RNA包含在水相中,水相的体积约相当于所加的Trizol试剂量的60%。(4)仔细吸取上层水相,移至另一EP管中。(5)加0.5ml异丙醇,以沉淀RNA(每1ml Trizol试剂加入0.5ml异丙醇),置室温10min。(6)4离心,10000g10min。RNA沉淀为一层如
10、凝胶样透明的小块附在管底和管壁。(7) 弃上清液,加入预冷的75%乙醇1ml(每1ml Trizol试剂加入75%乙醇至少1ml),震荡,充分洗涤沉淀,4离心,5500g5min。弃上清液,空气干燥(或真空干燥)后,沉淀重悬于无 Rnase dH2O中,吹吸几次,55-60作用10分钟以溶解RNA,-70保存备用。(8)抽提出的细胞总RNA干燥后加水50ul,取10ul加无Rnase水990ul,稀释100倍成1ml。于0.5cm厚的石英比色杯中,以无Rnase水为对照,在721型紫外分光光度计下检测,结果应为:A260/280 ratio1.6。(9)分离组织10mg(纯组织)加800ul
11、Trizol试剂。(10)扩增产物的鉴定:。DEPC处理方法如下:1. DEPC处理(1)DEPC水:100ml超纯水加入0.2ml DEPC,充分混匀,高压灭菌。(2)Tip头(枪头)、EP管等在提RNA过程中及做RT时接触RNA的器材(包括1ml、200l、20l Tip头;EP管和PCR反应管等):用0.1%的DEPC水(1000 ml超纯水加入1ml DEPC)37浸泡过夜,高压灭菌。2. 提取RNA,用DEPC水溶解3. RT我是用PCR仪来控制温度和时间的,所以RT是在PCR反应管中作的。4. 操作过程中要戴一次性手套,并经常换手套。最好把要直接接触样品的东西都用DEPC水处理一下
12、,枪头盒插好枪头后,加入1-2ml的0.1%DEPC水,在灭菌就行了;现在有进口的RNASE FREE的枪头买,直接用不用处理的如何消除污染机器运行完后,取出PCR产物时不能随便丢弃,应该用塑料手套或其他打结包好后丢入垃圾桶。(1) 试剂:mixer尽量分装,不要原瓶多次取用。(2)加样:原则是DNA最后加,其他试剂按照体积大小从大往小的加。如果是同种引物和探针有多管的话只是DNA不同,那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面,混合均匀之后再分装到各个管子里去,这样可以有效地避免误差及污染。另外,普通实验室容易污染,且污染程度很高,与跑电泳还有质粒制备提取都在同一个房间里有比较大的关系,最
13、容易造成高浓度污染的就是产物的开盖和质粒的稀释。目 前,国内外各个公司提供的诊断试剂盒大多采用了UNG来防污染。Uracil-DNA N-glycosylase(UNG)尿嘧啶DNA糖基酶,来源于大肠杆菌重组克隆表达。RNA定量RNA也最好至少要用电泳,一方面定量,另一方面可以看看完整性。至于用分光光度计比较 不同标本之间就更不准了。RNA的贮藏,最主要的是温度,20不够,最好80,液氮最保险mRNA是不能代替蛋白水平的分析的,因为还有翻译效率和RNA降解速度 的影响RT-PCR有两种做法: 条件具备的话可用kit进行一步法进行;若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结
14、果更加理想,条带特异性强且无拖尾现象,我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行一定要做内参的,每一次,我想。不作内参的结果是不可信的 电泳可以不一起跑,没有关系,计算的是相对表达程度,半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达 量,不是绝对表达量mRNA的分离与纯化中步骤(4)中将RNA溶液置65中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个,一个是破坏RNA的二级结构,尤其是mRNA Poly(A+)尾处的二级结构,使Poly(A+)尾充分暴露,从而提高Poly(A+)RNA的回收率;另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结 合,否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。下面,我们介绍一个可以
15、确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法。3)保温试验方法很简单的,按照样品浓度,从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积,然后密闭管盖。把其中一份放入70的恒温水浴中,保温1 h。另一份放置在-20冰箱中保存1 h。时间到了之后,取出两份样本进行电泳。电泳完成后,比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别(当然,它们的条带也要符合方法2中的条件), 则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染,RNA的质量很好。相反的,如果70保温的样本有明显的降解,则说明RNA溶液中有RNA酶污染。PCR污染与对策)PCR扩增产物污染.这是PCR反应中最主要最常见的污染问题,所以,扩增区的仪器什么如枪头等要注意。还有一种容易忽视,最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝,因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题.1标本处理区,包括扩增摸