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1、 细菌的简单染色法和革兰氏染色法陈慧霞 食品13102班 201313040201一 引言1.学习并掌握细菌简单染色法的原理和方法。2. 掌握革兰氏染色法的原理和操作技术，进一步巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术。二 实验原理1.简单染色法用单一染料进行细菌染色，操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察。一般情况下，细菌细胞通常带负电荷，易于和带正电荷的碱性染料结合而被染色。因此，常用碱性染料进行简单染色。常见的碱性染料有亚甲蓝、甲基紫、结晶紫、碱性复红、中性红、孔雀绿和番红等。2.革兰氏染色法革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。革兰氏染色的原理主要是因为两类细菌的细胞壁成分和
2、结构不同。革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了番红的颜色，因此呈现红色。而革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是肽聚糖的含量多且交联度大，类脂质含量少，当用乙醇处理时，肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，使结晶紫碘复合物被保留在细胞内而不易着色，因此，细胞仍保留初染时的颜色即呈现紫色。细菌先经碱性染料结晶紫染色，再经碘液媒染（以增加染料与细胞的亲和力）后，用乙醇脱色，再用番红染色。不被脱色而保持原颜色者为革兰氏阳性菌（G+）；被脱色后又被染上复染剂的颜色者为革兰氏阴性菌（G-）。三 实验材
3、料1简单染色法菌种：枯草芽孢杆菌试剂与器材：复红，接种环，酒精灯，打火机，载玻片，吸水纸。2革兰氏染色法菌种：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌染液：结晶紫染液，碘液，95%乙醇，番红染液，香柏。器材和试剂：洗净的载玻片，显微镜，酒精灯，接种环，擦镜纸，吸水纸，镊子，玻璃废液缸，蒸馏水等。四 实验步骤1.无菌操作：1.关闭窗户和风扇2.用酒精棉双手表面消毒3.接种环取菌前后焚烧灭菌4.棉塞靠近火焰不离手5.实验在酒精灯附近进行6.少说话2.简单染色法：l 准备玻片：取清洁干净的载玻片。l 涂片：滴一小滴无菌水于玻片中央，用接种环取枯草芽孢杆菌少许，与玻片上无菌水混匀，并涂成适当大小的薄层涂片。l 干燥：
4、将涂片在酒精灯火焰上方小心的轻微挥动使其干燥。l 固定：将干燥涂片（涂菌面向上）以适当的温度的从酒精灯火焰上通过2至3次。l 染色：滴1至2滴复红于涂片部位，染色1至3min。l 水洗：用洗瓶从玻片上端轻轻冲洗，直到下端流出的水无色，水流不宜太大。l 干燥：用吸水纸吸干玻片上的水 l 镜检：用显微镜观察玻片。2革兰氏染色法：革兰氏染色u 制片：取两块载玻片，在第一块玻片两个地方各滴一滴无菌水，用接种环分别取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混在其中，再拿第二块玻片，用接种环取玻片1两处液体制作一个混合菌的玻片。u 干燥：将载玻片放在酒精灯火焰上方小心地轻微挥动使其干燥u 固定：将干燥涂片不快不慢地从酒精
5、灯火焰上方通过23次。u 染色：1 初染：在混合菌的玻片上滴加结晶紫，染色1min;l 2 媒染：用碘液媒染1min;l 3 脱色：用95%乙醇脱色18s20s;l 4 复染：滴加番红复染2min5min。u 水洗：用洗瓶从玻片上端轻轻冲洗，直到下端流出的水无色。u 干燥：用吸水纸轻轻的将玻片上的水吸干。u 镜检：用显微镜观察玻片。五 结果与分析1) 枯草芽孢杆菌的形态是杆状的，经简单染色菌体变成红色2) 大肠杆菌的形态是杆状的，经革兰氏染色菌体颜色变成红色，说明大肠杆菌是革兰氏阴性（G）细菌。金黄色葡萄球菌的形态是球状的，经革兰氏染色菌体颜色变成蓝色，说明金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性（G）细菌。革兰氏染色简单染色六 作业与思考1细菌染色法的原理是什么？答：一般情况下，细菌细胞通常带负电荷，易于和带正电荷的碱性染料结合而被染色。2染色前细菌涂片为什么要用火焰固定？答：杀死了细菌,失细胞膜失去选择透过性,利于染液进入细胞中进行染色。七讨论与结论1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。2.涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性
