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1、MiR-200a/KEAP1/NRF2抗氧化信号通路对糖尿病动脉内皮的作用及机制研究糖尿病是一种严重威胁人类健康的慢性病,发病率逐年升高。糖尿病所致动脉病变是糖尿病足截肢的直接病因,致残、致死率高,严重影响居民健康,对社会经济造成巨大负担。然而糖尿病所致动脉病变机制未明,尚缺乏有效干预手段。糖尿病导致的动脉内皮损伤是糖尿病动脉病变发生的前期病理过程。因此探讨糖尿病动脉内皮损伤的发生机制、寻找有效的干预靶点对糖尿病动脉病变的防治意义重大。氧化应激是糖尿病致动脉内皮损伤的重要机制。核因子相关因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,NRF2)是
2、细胞抗氧化系统的核心调控因子,作为转录因子可进入细胞核启动多种抗氧化基因转录,提高细胞抗氧化能力,对抗糖尿病引起的细胞氧化应激损伤。因此,激活NRF2是减轻糖尿病动脉内皮损伤的有效策略。Kelch-like ECH-associated protein 1(KEAP1)蛋白是NRF2的关键负调控因子。在细胞质中,KEAP1与NRF2结合,阻止NRF2进入细胞核发挥转录因子作用。此外,KEAP1还诱导NRF2经蛋白酶体降解。由此可见,抑制KEAP1是激活NRF2的有效手段。我们前期研究显示,KEAP1的特异性小分子抑制剂dimethyl fumarate可激活NRF2,提高细胞抗氧化能力。除抑制
3、KEAP1蛋白功能外,在m RNA水平调控Keap1表达、降低KEAP1蛋白表达量亦可能是激活NRF2的有效手段。然而目前对Keap1 m RNA的表达调控机制尚不清楚。Micro RNA(miRNA)是一类具有转录后调节活性、高度保守、长度为1825个碱基的内源性非编码单链RNA。MiRNA与靶m RNA的3untranslated region(3UTR)互补结合,直接降解靶m RNA或抑制靶蛋白的翻译过程。我们的前期研究发现miR-200a可在糖尿病肾脏中降解Keap1 m RNA、激活NRF2通路。然而miR-200a对糖尿病动脉内皮损伤的作用及机制尚不明确。目的:1.观察miR-20
4、0a/KEAP1/NRF2信号通路对糖尿病动脉内皮损伤的作用。2.分别探讨KEAP1和NRF2在介导miR-200a/KEAP1/NRF2抗氧化信号通路效应的作用。方法:1.采用高糖分别处理原代培养的野生型小鼠动脉内皮细胞1 h、6 h、12 h、24 h、48 h,观察对miR-200a/KEAP1/NRF2信号通路、氧化应激、炎症因子表达的影响。2.为观察miR-200a对糖尿病动脉内皮细胞Keap1、NRF2通路表达,以及氧化应激、炎症因子表达的影响,采用高糖及miR-200a的特异性模拟剂(miR-200a-M)、抑制剂(miR-200a-I)及各自阴性对照处理野生型小鼠动脉内皮细胞。
5、3.为探讨KEAP1在介导miR-200a效应中的作用,应用高糖、Keap1 siRNA、miR-200a-M共处理野生型小鼠动脉内皮细胞,观察对miR-200a/KEAP1/NRF2通路、氧化应激、炎症反应的影响。4.为探讨NRF2在介导miR-200a效应中的作用,以原代培养的野生型和Nrf2基因敲除糖尿病小鼠动脉内皮细胞为研究对象,观察并对比高糖、miR-200a-M对miR-200a/KEAP1/NRF2通路、氧化应激、炎症反应的影响。5.为进一步在体内探讨miR-200a-M对糖尿病动脉内皮损伤的作用及机制,采用多次低剂量链脲佐菌素(STZ)腹腔注射的方法建立野生型和Nrf2基因敲除
6、糖尿病小鼠模型。糖尿病成模的同时给予皮下注射miR-200a-M的方式进行干预,观察并对比miR-200a-M对野生型、Nrf2基因敲除糖尿病小鼠动脉miR-200a/KEAP1/NRF2通路、氧化应激、炎症反应的作用。6.为评估miR-200a-M对糖尿病动脉内皮功能障碍的作用,实验结束时评估野生型和Nrf2基因敲除糖尿病小鼠动脉收缩、舒张功能,并绘制张力曲线。结果:1.随高糖刺激时间的延长,miR-200a水平逐渐降低,Keap1基因表达逐渐增强,细胞内总NRF2蛋白水平逐渐降低。高糖刺激48 h(终末时间点)时细胞核内NRF2蛋白下游抗氧化基因Ho1、Nqo1 m RNA水平降至最低,氧
7、化应激指标ROS、MDA及炎症基因Vcam-1、Mcp-1 m RNA水平升高最显著。2.MiR-200a-M可显著上调高糖处理的野生型小鼠动脉内皮细胞miR-200a水平、抑制Keap1基因表达、激活NRF2信号通路的表达,并减轻氧化应激和炎症反应。与之相反,miR-200a-I可显著下调高糖处理的野生型小鼠动脉内皮细胞miR-200a水平、促进Keap1基因表达、抑制NRF2信号通路的表达,加重氧化应激和炎症反应。3.在高糖和Keap1 siRNA共处理的野生型小鼠动脉内皮细胞中,尽管miR-200a-M仍可上调miR-200a水平,却未能进一步激活NRF2通路及减轻氧化应激及炎症反应。4
8、.在Nrf2基因敲除小鼠动脉内皮细胞中,miR-200a-M完全丧失上调Ho1、Nqo1表达、抑制氧化应激和炎症反应的能力。5.MiR-200a-M可有效上调野生型及Nrf2基因敲除糖尿病小鼠动脉miR-200a水平、抑制Keap1基因表达。MiR-200a-M可激活野生型小鼠动脉NRF2通路表达,并减轻氧化应激及炎症反应;这些作用在Nrf2基因敲除小鼠中完全消失。6.MiR-200a-M可改善野生型糖尿病小鼠动脉内皮收缩、舒张功能障碍,但对Nrf2基因敲除小鼠无上述作用。结论:1.MiR-200a可通过miR-200a/KEAP1/NRF2信号通路降低氧化应激水平,对糖尿病动脉内皮提供保护。2.KEAP1和NRF2完全介导miR-200a对高糖动脉内皮细胞的保护效应。3.上调miR-200a水平是减轻糖尿病动脉内皮损伤的有效手段。
