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1、基因工程复习题一、 名词解释1、基因工程：在分子水平上，提取或合成不同生物的遗传物质，在体外进行切割、再和某一载体进行拼接重组，然后再将重组的DNA导入宿主细胞内，最后实现目的基因稳定复制和表达的过程。简单说指异源重组DNA在受体细胞的扩增与表达。2、限制性核算内切酶：一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。切开的是3,5磷酸二酯键。3、星号活性：在“非最适的”反应条件下,有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子，这种现象叫星号活性，用*表示。4、载体：将外源基因导入受体细胞的工具叫载体
2、（Vector）。载体本身也是DNA分子。5、电泳：带电物质在电场中向相反电极移动的现象。6、PCR（聚合酶链式反应)：一个DNA经n次扩增后, 一个DNA分子可变为2n个分子，PCR扩增前需要对待扩增的DNA序列有所了解，至少要对其两侧的核苷酸序列为已知，以便合成寡核苷酸引物 。 7、感受态细胞：Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态.8、多克隆位点（MCS）：载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制性核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。9、松弛型质粒：此类质粒的复制受宿主的控制比较松，在宿主细胞中拷贝数较多（1020
3、0个）。10、Cos位点（柯斯质粒）：柯斯质粒是一类人工构建的含有lDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，DNA长度为48502bp，在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。当其注入到寄主细胞中后，可以迅速通过这两个粘性末端的互补作用形成双链的环形DNA分子。上述通过粘性末端互补形成的双链区被称为cos位点（cohesive end site）。11、基因文库：将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片段，并将所有这些片段都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物的全部基因，称为基因文库。12、转化率：每微克载体DNA在最
4、佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数。13、转化子：将导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。14、重组子：含有重组DNA分子的转化子称为重组子。二、问答题。1、说明用同聚物加尾法进行cDNA克隆的远离及操作步骤。6、简述溶液、所包含成分及生化作用原理。答：溶液I：50 mMol/L葡萄糖, 25 mMol/L Tris-Cl, 10 mMol/L EDTA,pH 8.0；溶液II：0.2 mMol/L NaOH , 1% SDS(
5、现用现配);溶液III：3Mol/L醋酸钾, 2 Mol/L 醋酸(1)葡萄糖:增加黏度、防止DNA受机械作用而降解；助于菌体悬浮、无结块;(2) EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂、可把菌体中所有二价金属离子都螯合掉，抑制DNase的活性、抑制微生物生长。(3)新鲜的NaOH，是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性(0.2 mMol/L NaOH pH12.6 ); NaOH是最佳的溶解细胞的试剂、DNA的变性剂;SDS也是碱性的，表面活性剂、溶解细胞膜上脂肪和蛋白质，使蛋白质变性而沉淀下来。(4)醋酸中和NaOH，质粒DNA复性、并稳定存在;K+-SDS-蛋白
6、复合物使基因组DAN沉淀更完全 。7、基因工程诞生的三大理论基础是什么？答：1、DNA是遗传物质被证实2、DNA双螺旋模型的提出3、“中心法则”和“操纵子学说”的提出8、逆转录酶是一种多功能酶，主要有三种酶活性分别是什么？答：1、依赖于RNA的DNA聚合酶功能。 2、RNaseH功能：水解DNA-RNA杂交分子中的RNA链。 3、依赖于DNA的DNA聚合酶功能。 9、作为基因克隆载体必须具备的5个特性是什么？答：载体必须是复制子。具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入。自身分子量较小，拷贝数高。在宿主细胞内稳定性高。10、核算凝胶电泳的原理是什么？答：
7、1）核算分子之糖-另算骨架中的磷酸集团，呈负离子化状态；核算分子在一定的电场强度中，它们会向正电极方向迁移；2）由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质，电泳迁移率（或迁移速度）与分子的摩擦系数成反比。而摩擦系数的分子大小（构型）、介质粘度等的函数；因此，可在同一凝胶中、一定电场强度下、可在凝胶上分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的核算分子。11、 缺口平移法标记探针的原理及过程。反应体系中DNA酶1随即在探针DNA上打开缺口，然后利用DNA聚合酶1 53的外切酶活性，在缺口处按53方向切除单核苷酸；同时DNA酶1有53的聚合酶活性，在缺口处3端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处
8、的核苷酸连。随着反应的进行底物中被标记单核苷酸，并被随机掺入 。DNA聚合酶1的两种作用交替进行，探针即被标记。12影响cDNA合成质量的首要因素就是总RNA和ply A+ RNA的完整度和纯度。13如何简便快速的检测？19影响cDNA合成质量的首要因素就是总RNA和ply A+ RNA的完整度和纯度。如何检测？影响cDNA合成质量的首要因素就是总RNA和ply A+ RNA的完整度和纯度。（小部分的RNA 置于37 2h ,同时其它的RNA置于 -70 2h 后一起电泳）。总RNA 展示主要两条带，分别对应28S 和18S 核糖体RNA，它们之间的亮度比率约为121（如果28S18S 低于1
9、1则不能用于RACE）；还有一条分子量较小的带5S tRNA。哺乳动物的Poly A+ RNA 会产生0.512 kb 的弥散带，亮度较核糖体RNA带弱。14、 鸟枪法克隆目的基因的基本操作过程是什么？随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离。（1） 染色体DNA的切断 超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端。 全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控。 部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整。 （2） 与载体连接 如
10、果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体。（3） 转化受体细胞如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞。（4） 筛选含有目的基因的目的重组子菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）。15、 如何计算重组率？如何提高重组率？计算重组率重组率的定义重组率 = 含有外源DNA的重组分子数 / 载体分子总数在常规实验条件下，重组率一般为25 75%重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可
11、以大大简化DNA重组的后续操作。进行体外重组(体外的连接反应)注重的插入片段和载体的比值。提高重组率的方法提高外源DNA片段与载体的分子比：5 : 1 10 : 1 载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团： 特别针对单酶切连接加装同聚尾末端16、简述重组DNA分子转化哺乳动物细胞的方法有几种？17、使用噬菌斑原位杂交法检测克隆DNA序列的方法中，杂交探针标记的方法有哪几种？答：1、T4-PNP介导的末端标记2、逆转录酶介导的反转录标记3、DNA聚合酶介导的缺刻前移标记 4、ABC荧光标记5、ABC显色酶标记 6、地高辛系统标记18、双脱氧末端终止法是谁发明的？其原理是什么？答：F.桑格原理：DN
12、A序列测定是精确鉴定目的基因的重要手段，目前国际上流行采用Sanger发明的双脱氧末端终止法测定DNA序列，其工作原理是在DNA聚合反应的进程中，通过位点特异性终止测定DNA序列其关键技术有：DNA链聚合反应时的定点随机中断（ddNTP） 聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率（600 bp / 601 bp）电脑自动检测、记录、编辑程序用于DNA测序的专一性试剂盒（Kit） 20、PCR技术的应用在哪些方面？答：1、遗传疾病的诊断2、传染病的诊断 3、基因的快速克隆 4、基因突变1）缺失突变 2）插入突变 3）点突变-单点和多点突变5、序列分析6、检测基因表达7、进化分析 21、基因文库的完备性的计算
13、公式是什么，并解释公式中各符号代表什么？答：N=ln(1-p)/ln(1-f)p：文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）f：插入载体的DNA片段的平均长度占整个基因组DNA的百分数N：所需的重组载体数（克隆数）22、cDNA文库的特点是什么？答：1、基因特异性。常来自结构基因，因此仅代表某种生物的一小部分遗传信息，且只代表那些正在表达的基因的遗传信息：15% mRNA，80 85% rRNA，10 15% tRNA 2、器官特异性。不同器官或组织的功能不一样，因而有的结构基因的表达就具有器官特异性，故由不同器官提取的mRNA所组建的cDNA文库也就不同3、代谢或发育特异性。处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因表达亦不相同。 4、不均匀性。在同一个cDNA文库中，不同类型的cDNA分子的数目是大不相同的，尽管它们都是由单拷贝基因转录而来的。这与基因组文库中的单拷贝基因均具有相同的克隆数，这是两种文库的另一差别。5、各cDNA均可获得表达（一般选用的载体都是表达型的）
