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1、电子克隆及相关软件介绍 郭奕斌 医学遗传学教研室 目 录 一、何谓电子克隆？ 二、传统的cDNA 克隆过程 三、主要数据库及电子克隆所需软件（P16） 四、常用分子生物学软件介绍 概 述 众所周知，新基因的搜寻和蛋白质功能分析是今后的研究热点，随着人类基因组计划（Human Genome Project, HGP）研究的不断深入，表达序列标签（Expressed Sequence Tag, EST）在基因组研究尤其是人类基因和模式生物新基因鉴定中的应用也日益广泛。因此，利用人类基因组计划的研究成果以及网络大量生物信息资源，通过物种表达序列标签数据库，运用电子克隆的方法获得人类基因以及在其他物种
2、中的同源基因的cDNA全序列，从而为今后大规模快速克隆新的功能基因，开展其结构与功能等研究奠定了基础。 一. 何谓电子克隆 通过对物种数据库中的大量表达序列标签EST进行分类、整合、组装，可以得到潜在的全长cDNA，这种方法即电子克隆，也有人称之为计算机克隆或硅片克隆（in silico cloning）。详言之，电子克隆就是以数学算法为手段，以计算机和互联网为工具，利用现有的EST和生物信息数据库，在未注释的人类基因组序列上发掘未知功能的新基因，并通过生物学实验进行编码序列和功能验证，从而得到新基因的一种方法。 其过程是通过将互为重叠的某物种EST序列进行排列，然后进行比对即可获知该物种某基
3、因全长cDNA序列。与实验室克隆大片段的真核基因组DNA或cDNA繁杂、耗时、效率不高的过程相比，电子克隆方法更为快速、精确且适用性强。随着多种模式生物的基因组测序工作的完成，EST分析必将广泛用于指导物种的新基因发现。 二、传统的cDNA克隆过程 1.用反转录酶在oligo(dT)引导下合成cDNA 第一链； 2.用RNA酶H和大肠杆菌DNA聚合酶I合成cDNA 第二链； 3.EcoRI位点的甲基化（若用NotI或SalI，则不需） 4.与磷酸化EcoRI接头相连接并消化接头产生粘端； 5.根据大小筛选cDNA片段 ； 6、连接到噬菌体臂，将DNA包装入噬菌体颗粒，并在大肠杆菌中铺平板进行检
4、测； 7、小量提取噬菌体，分析cDNA 插入片段； 8、产生完整的cDNA 文库； 9、扩增cDNA 文库。 三、主要数据库及电子克隆所需软件 (一)常用医学生物信息学数据库 综合数据库； 核酸类数据库； 蛋白质相关数据库； 细胞生物学数据库； 微生物学数据库； 疾病相关数据库； 药物相关数据库； 其他数据库。 综合数据库包括： 1. DBCAT生物学数据库目录； 2. 分子生物学相关数据库集锦； 3. MedWebPlus医疗卫生相关资源集锦； 4. NCBI资源数据库； 核酸类数据库主要包括： 1.通用核苷酸序列数据库； 2.外显子/内含子数据库； 3.基因表达及表达调控数据库； 4.RN
5、A相关数据库； 5.核酸突变类数据库 蛋白质相关数据库包括： 1.通用蛋白质数据库； 2.蛋白质序列与结构数据库； 3.蛋白质家族及其相互作用数据库； 4.酶类数据库； 5.信号传导及分子间相互作用数据库； 6.特殊蛋白质及其功能数据库； 细胞生物学数据库包括： 1.线粒体类数据库； 2.SCDb干细胞数据库； 微生物学数据库包括： 1.EMGLib增强的微生物基因组文库； 2.EcoCyc & MetaCycE.coli基因组及 微生物代谢通路数据库； 3.yMGV全球酵母微阵列Microarray 实验数据库； 疾病相关数据库包括： 1.综合临床数据库； 2.遗传性疾病数据库； 3.肿瘤相
6、关数据库； 4.心血管疾病相关数据库； 5.免疫性疾病数据库； 药物相关数据库包括： 1.药物类数据库；2.新药数据库 其他数据库包括： 1.LocusLink与RefSeqNCBI的基因核心资 源；2.GeneNet基因网络的结构与功能组织 数据库；3.ELS生命科学百科全书。 核酸类数据库 通用核苷酸序列数据库 包括：GenBankNCBI核苷酸序列数据库；EMBL欧洲核苷酸序列数据库；DDBJ日本DNA数据库；TIGR表达基因序列标签数据库；MIPS慕尼黑基因组及蛋白序列数据库。 外显子/内含子数据库 包括：EID外显子/内含子数据库； ExInt外显子/内含子数据库； 基因表达及表达调
7、控数据库又包括：EPD 真核基因启动子数据库；ASDB基因选 择性剪接数据库；TRRD转录调控区数据库； TRANSFAC基因表达调控系统数据库； PEDB前列腺基因表达数据库；MAGEST 海鞘类生物基因表达模式及序列标记数据库。 RNA相关数据库又包括： Transterm mRNA序列和翻译调控元件数据库； UTRdb 真核生物mRNA 5和3端非翻译区序列和功能元件 数据库； 核糖体数据库； 5S核糖体RNA数据库； 欧洲核糖体RNA大亚基数据库； 欧洲核糖体RNA小亚基数据库； tmRDBtmRNA数据库； RNAi数据库 核酸突变类数据库又包括： HGVbaseSNPs及其他基因多
8、态性的 数据库； dbSNP单核苷酸多态性数据库 (二)电子克隆所用数据库和所需软件 1、主要数据库 （1）核酸数据库 为美国国立生物技术信息中心（NCBI）GenBank数据库（http:/.nih.gov/Database/index.html） （2）美国基因组研究所（TIGR）TGI数据库（http:/ 2、所需软件 （1）核酸序列同源性分析软件使用BLASTN （http:/.nih.gov/BLAST/, NCBI,USA） WU-BLAST 2.0（http:/ Washington University BLAST）， （2）序列匹配分析软件用Clustal W 1.8（EMB
9、L, Germany） （3）GeneDOC.用ORF Finder(NCBI,USA)寻找核酸序列开发阅读框架 （4）将所选EST组装为连续体软件用ESTmachine（http:/ 四、分子生物学软件介绍 分子生物学专业软件的种类： 1、纯商业软件（只提供软件功能演示）； 2、商业共享演示软件（全部或部分软件功 能但使用时间极为有限）； 3、免费软件。 对于前两种软件而言，只有付出一定的费用, 才会得到全功能的商业软件，而后者却完全免费。 (一)软件在分子生物学领域应用的重要性 在分子生物学研究领域中，引物设计、多序列比较分析、基因进化树结构分析、核酸/蛋白质高级结构预测等等，若单纯依靠手
10、工设计与分析，几乎很难达到理想要求。而通过使用分子生物学专业软件，则可以很轻松地设计出符合要求的引物、简便快速地进行多序列的分析比较等。不仅如此，它还可制作具有专业水平的图形图像，如质粒图谱、克隆表达载体构建图谱、限制性酶切片段图谱等。 分子生物学专业软件应用可以比较方便地解决 研究人员从立项到最后写论文的实际问题，它在 分子生物学的应用范围主要有： 研究资料收集整理(如序列查询、文献检索),序 列分析和实验设计（如引物设计、限制性酶切分 析、同源序列比较、质粒作图、蛋白二级结构预 测、蛋白三级结构显示、序列格式转换、DNA测序 样品原始胶图文件分析等）,实验数据统计和分析 (如电泳条带定量分
11、析、数据统计分析作图）、论 文写作和发表（如文献引用、生成发表质量的图 片、序列递交）。 (二) 免费软件的索取与应用 从国际互联网Internet中可以发现并收集到大量分子生物学医、教、研免费软件。其中，大部分应用软件均由生物学家、化学家和软件开发者所写。 1.免费软件与商业软件 当分子生物学家的科研需要一类新的分析演算法则时，就将其具体化成软件，如大部分免费的基本分子生物学序列分析软件包均是由生物科学家开发的，包括FastA、 BLAST、 Clustal、 MFOLD、 PHYLIP、 Paup、 CAP等。通常此类软件的源代码属于免费共享。与商业软件相比，免费软件往往在用户界面、易用性及集成性方面稍逊一畴， 而且，商业软件包在软件的升级支持、技术支持等方面也有一定的优势。因此，在资金许可的情况下，商业软件通常是一种更好的选择。但免费软件的最大优势就在于它为广大从事分子生物学研究的相关人员提供了专业性相关最好的软件资源，甚至某此免费软件提供的功能比商业软件更强大，或者还提供了商业软件未能提供的功能。 此外，随着生物信息和生物电脑化的飞速发展，许多优秀的程序员都正在开发软件，其中许多人将此类软件作为一种免费软件。 现在，许多免费软件都特别注重用户界面、易用性及集成性。对于大部分科学应用软件，由于其潜在的市场非常小，以致于有时免费软件包与昂贵的商业软件包在功能
