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1、酶免疫技术（Enzyme Immunoassay, EIA）了解：1. 酶免疫技术中相关技术环节2. 酶免疫测定的应用理解：1. 酶免疫技术的分类、测定原理及主要类型2. 酶免疫技术的特点掌握：ELISA的基本原理、主要类型、方法、步骤、结果判断一、酶免疫技术概述（一）基本原理：利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高特异性抗原-抗体反应的检测敏感性的一种标记免疫 技术。EIA：抗原抗体反应的特异性、酶高效催化的专一性（二）基本特点：1. 标记后保留酶和抗原（抗体）的活性2. 酶促反应专一性，保证特异性3. 底物反应放大作用，提高敏感性4. 酶标试剂保存稳定5. 操作简便，安全易行（三）主要试剂
2、的制备与要求：1. 酶与酶作用底物（1）用于标记酶的要求： 酶活性高 标记后酶活性稳定,不影响抗原抗体的免疫反应性 酶催化底物后信号易判定或测定 酶活性不受样品中其他成分的影响 酶、辅因子及底物理化性质稳定,安全无害、价廉（2）常用酶酶底物辣根过氧化物酶（HRP）邻苯二胺（OPD）：反应显橙黄色，应避光，致癌性四甲基联苯胺（TMB）：反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性，但水溶性差碱性磷酸酶（ALP）对硝基苯磷酸酯（p-NPP）：产物为黄色ALP灵敏性高于HRP，不易获得纯品，稳定性及酶标记物收率低于HRP，价高，应用不如HRP普及2. 酶标记抗体或抗原（1）通过化学反应或者免疫学反应，让酶与抗体
3、或抗原形成结合物，也称酶标志物或酶结合物。（2）酶结合物（conjugate）： 酶免疫技术的核心组成部分 直接影响酶免疫技术的应用效果 它的制备是酶免疫技术中非常关键的一个环节（3）基本要求：抗原抗体酶标记抗原纯度要咼抗体的特异性好/效价高/亲和力强/比活性高抗原性完整易于批量生产和分离纯化（4）酶标记方法 戊二醛交联法 改良过碘酸钠法（直接法）3. 固相载体 目的：分离游离和结合的酶标志物（1）基本要求 结合容量高，结合稳定 可与抗原抗体复合物等大分子蛋白结合 生物大分子固化后仍保持活性 固化方法简便易行、快捷经济（2）固相载体的种类与选择1）塑料制品（聚苯乙烯）：材料经济，操作简便，易于
4、自动化，最常用2）微颗粒（免疫磁珠）：结合容量大，反应迅速，普遍用于自动化分析3）膜载体（western-blot）：硝酸纤维素膜（NC）、尼龙膜等微孔滤膜，广泛应用于定性或半定量的斑点ELISA（3）包被与封闭1）包被（coating）：将抗原或抗体结合在固相载体上的过程，一般采用偏碱（pH 9.6）的碳酸盐溶液2）封闭（blocking）： 1%-5%牛血清白蛋白或5%-20%小牛血清，再包被以消除固相载体未覆盖位点产生的非特 异干扰、酶免疫技术的分类一）均相酶免疫测定基本原理利用酶标抗体结合抗原形成复合物后，标记酶的活性发生改变的原理，在不将复合物与游离酶标抗体分离的情抗原抗体反应后，先
5、将抗原抗体复合物与游离的酶标抗体分离，再测定酶标记的复合物催化底物显色的活性 进而推算出样品中抗原的含量。液相EIA：分离剂分离游离的和结合的标记物固相EIA：固相载体结合酶标复合物：ELISA 三、酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA）（一）基本方法及步骤1. 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。2. 把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体反应。3. 洗涤：使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质 的量成一定的比例
6、。4. 加入酶的底物，底物被酶催化为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据颜色反应的深浅进 行定性或定量分析。（二）3种必要的试剂：1. 固相的抗原或抗体2. 酶标记的抗原或抗体3. 酶作用的底物（三）ELISA检测未知抗原：双抗体夹心法、双位点一步法、竞争法I检测未知抗体：间接法、双抗原夹心法、竞争法、捕获法1. 检测未知抗原(1) 双抗夹心 ELISA1) 特点： 用于抗原的检测 适合含至少两个表位的多价抗原的检测 所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原决定簇 非竞争结合反应2) 操作流程：包被抗体洗涤封闭洗涤加入待检标本、待检抗原、无关抗原孵育、洗涤加入酶标抗体孵育、
7、洗涤加入底物tmb -显色-终止-测量0D值3) 影响因素： 样本采集：溶血标本禁用 试剂因素：单克隆抗体、正确保存 操作因素：加样：吸嘴的洁净与否和吸量的准确性温浴：尽可能使用水浴洗涤：ELISA操作的重要环节显色：避光(2) 双位点一步法特点: 双抗体夹心法发展而来 方便快捷 防止“钩状效应”，导致假阴性(3) 竞争 ELISA1) 原理:机桅悔8啊Till羁钩憫羁一I T 1 I丫丫丫 r2) 特点： 用于小抗原和半抗原(药物、激素等)的定量测定 酶标Ag与样品或标准品中的非标记Ag具有相同的与固相Ab结合的能力。 固相Ab和酶标Ag量是固定的，且前者结合位点少于酶标记与非标记Ag的分子
8、数量和。 显色结果与样品中非标记Ag的浓度成反比。2. 检测未知抗体(1) 间接 ELISA特点: 检测抗体最常用的方法 检测 IgG 应用广泛 非竞争结合反应(2) 双抗原夹心法1） 原理:T2） 特点: 用于所有类型 Ig 的检测 非竞争结合反应 常用乙肝表面抗体的测定（3）捕获法主要用于急性感染血清抗体亚型IgM的测定（HAV-IgM、HBc-IgM） 四、酶免疫测定的应用应用：1. 检测病原体抗原：病毒：肝炎病毒、风疹病毒、疱疹病毒等细菌：链球菌、结核分枝杆菌、幽门螺杆菌等 寄生虫：弓形体、阿米巴、疟原虫等2. 蛋白质：各种免疫球蛋白、补体组分、肿瘤标志物（例如AFP、CEA、PSA）、多种血浆蛋白质、同工酶、激素（如 HCG、TSH）3. 药物和毒品：地高辛、苯巴比妥、庆大霉素、吗啡等小结：1. 酶免疫技术的分类2. 酶标记常用底物与酶3. 简述ELISA的基本原理、方法类型及应用复习思考题：1. 名词概念：ELISA、EIA、Coating、Blocking2. 思考题：简述酶免疫技术的分类简述ELISA的基本原理、方法类型及应用
