《电喷雾质谱在非共价蛋白复合物研究中的应用样本.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《电喷雾质谱在非共价蛋白复合物研究中的应用样本.doc（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、电喷雾质谱在非共价蛋白复合物研究中应用1. 前言质谱作为一种分析办法，长期以来始终用于小分子化合物构造分析。直到80 年代末电喷雾电离质谱（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）和基体辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）两种“软电离（soft ionization）”质谱浮现，才将质谱分析范畴扩大到生物大分子构造分析。在生物界，生物分子非共价特殊作用是分子辨认基本
2、。因而，非共价复合物检查在生物学上是一种重要研究课题。虽然MALDI-TOF较高敏捷度和Mr表征范畴对于测定生物大分子物质优于ESI质谱，但是它在检测非共价复合物应用上却受到供试品制备条件限制1刘益华，徐俊福.基质辅助激光解吸飞行时间质谱在生物大分子中应用.中华人民共和国生化药物杂志.，25(3)：192-193。而ESI-MS对蛋白质复合物研究在样品用量少、迅速状况下可得到可靠数据和较多信息。由于其具备敏捷度高、迅速和质量精准度高长处，复合物化学计量比可以很容易地推导出。通过变化源锥孔（cone）电压、变化溶液pH 值和进样毛细管温度，可以比较不同化合物与蛋白质亲合力大小2Parmanik
3、BN，Bartner PL，Mirza UA，et al. Electrospray ionization mass spectrometry for the study of non-covalent complexes：an emerging technologyJ. J Mass Spectrom,1998，33(10):911-920。对非共价键复合物进行某些酶解或完全酶解，还可以拟定小分子与蛋白质结合位点3Millar AL，Nicholas AC，Jackson NAC，et al. Rapid analysis of epitope-paratope interactions b
4、etween HIV-1 and a 17-amino-acid neutralizing microantibody by electrospray ionization mass spectrometryJ. Eur J Biochem,1998,258(1):164-169.。可见，ESI-MS可广泛用于研究蛋白质非共价键复合物。到当前为止，用ESI-MS观测到不同非共价键复合物涉及蛋白质-蛋白质4Ogorzalekloo RR，Goodlett DR，Smith RD，et al. Observation of a noncovalent ribonuclease S-protein
5、S-peptide complex by electrospray ionization mass spectrometryJ，J AM Chem Soc,1993,115(10):4391-4392，蛋白质-配体5Robinson CV，Chung EW，Kragelend BB，et al. Probing the nature of noncovalent interaction by mass spectrometry. A study of protein-CoA ligand binding and assemblyJ. J Am Chem Soc,1996,118(36):864
6、6-8653，蛋白质-寡核苷酸6Light-Wahl KJ，Springer DL，Winger BE，et al. Observation of a small oligonucleotide duplex by electrospray ionization mass spectrometryJ. J Am Chem Soc，1993,115(2):803-804.和蛋白质-双链DNA7Cheng XH，Morin PE，Harms AC，et al. Mass spectrometry characterization of sequence-specific complexes of
7、DNA and transcription factor PU.1 DNA binding domainJ. Anal biochem,1996,239(1):35-40.及蛋白质-金属离子等8Hu P，Loo JA. Gas-phase coordination properties of Zn2+,Cu2+,Ni2+，and Co2+ with histidine -containing peptidesJ. J AM Chem Soc,1995,117(45):11314-11319.。2. 电喷雾质谱（ESI-MS）基本原理及特点其原理是9,10 岳贵花，许崇峰，卞利萍等.电喷雾质谱在
8、非共价蛋白复合物研究中应用. 分析化学学报,16(6):495-502. 王红霞，杨松成.蛋白质非共价复合物电喷雾质谱研究进展.药学学报,36(4):315-320. :在高压电场下，少量液体在雾化气作用下形成溶剂化离子飞向电极，在这一过程中，受外界条件作用（如逆向干燥气流），逐渐脱溶剂化以致最后溶质离子从该溶剂化离子中解吸出来形成带多电荷分子离子进入质谱。电喷雾电离特点是蛋白质等生物分子能产生多电荷离子，使质荷比减少到多数质谱仪都可以检测范畴，因而大大扩大了分子量分析范畴。分析物离子真实分子量可以依照质荷比及所带电荷数计算，普通由计算机软件完毕。电喷雾质谱可充许有少量盐和缓冲液，但盐和缓冲液
9、存在会使仪器敏捷度减少。电喷雾质谱长处是可以以便地与各种分离技术联用，如液质联用和毛细管电泳质谱联用等。3 喷雾质谱（ESI-MS）在蛋白质非共价键复合物研究应用自1991年Ganem11Ganem B，LI YT，Henion JD. Detction noncovalent receptor-ligand complexes by mass spectrometryJ. J Am Chem Soc，1991,113(16):6249-6296.等最早应用电喷雾质谱研究细胞浆中受体蛋白FKBP12及其配体FK506和rapamycin非共价键复合物以来，该技术被越来越多学者所应用。关于蛋白质
10、配体以及构成蛋白质各亚基间非共价互相作用文献报道诸多，Joseph12Joseph A Loo. Mass Spectrom. ReviewJ,1997,16:1.列出了近年来ESIMS在这一领域研究进展。3.1 蛋白质蛋白质互相作用诸多蛋白质在体内实验中互相作用很强，而相似蛋白质寡聚体或其她形成功能蛋白复合体互相作用很弱。ESI-MS也允许以通过质量测定对蛋白质蛋白质复合体构造供应直接、明确信息。与其她光谱技术相比，这种技术有诸多优势，例如，测定余因子依赖蛋白质-蛋白质互相作用84。4-草酸丁烯酸酯异构体酶四级构造是第一次采用ESI-MS进行分析寡聚蛋白86。依照分子筛色谱和超速离心，以为4
11、-草酸丁烯酸酯异构体酶为五倍体87。X射线衍射和质谱明确显示此蛋白质为一种41kDa六倍体(86,88)。另一方面，四个单点突变4-草酸丁烯酸酯异构体酶只能形成单体蛋白质离子。这些数据阐明自然蛋白具备寡聚行为，残基对保持六倍体构造有重要作用。在Standing等研究基本上，其她研究小组也开始用ESI-MS分析已知和未知寡聚蛋白质复合体化学计量式。在proteasome催化蛋白（89,90），chaperone complex GroEL91，和各种血色素92-96研究中均得到有趣成果。ESI-MS实验证明GroEL由两个七倍体环构成，并非共价结合14亚单元，总分子质量为800kDa91。Gro
12、EL在拥有co-chaperoneGroES前提下才具备活性。进一步用MS研究GroES可变某些与模型底物helix D互相作用97。结合荧光交联实验得到甚至在GroEL四倍体上也有GroES及底物蛋白明显，至少式某些结合位点。依照MS研究，在大多数哺乳动物系统中血色素以分子量约为60kDa四倍体存在，在低浓度下则很也许以二倍体存在。MS广泛用于研究血色素构造。例如，镰刀红血球患者组织血液中血色素S和胎儿血色素98。此研究总结了镰刀红血球病不均匀血色素混合物和其她四聚体定量测定。因此，血红素亚基非共价结合可用ESI-MS进行研究。质谱显示患者和胎儿血液均具有包括22、2两种杂交体完整血红素四倍
13、体。依照不均匀血色素杂和物质量测定，发当前患者血液中有一种平均质量为64.6kDa独特四倍体标记蛋白。另一种先进研究显示MS可用于甲状腺传递系统寡聚蛋白分析99。四倍体人类蛋白质reansthyretin通过与维生素A结合蛋白非共价结合传递荷尔蒙甲状腺素。Transthyretin被以为淀粉纤维构成成分，并与某些疾病如Alzheimers，二型糖尿病和遗传性海绵状组织脑病关于。在正常状况下，transthyretin运送甲状腺素和维生素A，但是天然型展开和单点突变分别导致老年系统淀粉样变性病和家族淀粉质神经病。Transthyretin四倍体分裂被以为是形成淀粉状纤维第一步100。McCamm
14、on等用MS实验了18种这一过程抑制剂(99)。测定了这些配体结合，稳定四倍体构造，与transthyretin复合体互相作用及与自然配体甲状腺素竞争能力。通过对具有六个蛋白质亚基，两个维生素A分子和两个合成配体（四个transthyretin和两个维生素A结合蛋白）多面十组分复合物研究发现配体加入不会抑制transthyretin与维生素A结合。甲状腺素与作为探针人工合成配体作用特点则不同样。研究积极、悲观与无作用机理；并证明人工配基对甲状腺素结合产生悲观影响。Loo等对ADH(Alcohol Dehydrogenase)锌金属酶在乙醛、乙醇互变中作用进行了研究，表白酵母及哺乳动物ADHs都
15、是均质，在这个过程中，仅有25残基参加互变。在ESIMS分析蛋白质亚基构造过程中，溶液pH及离子源条件都很重要，在不同pH值下，蛋白质以不同数目亚基汇集体存在。这对咱们研究蛋白质性质具备重要意义。Standing等Fitzgerrald M C，Chermushevish I，Standing K G，et al. Acad. Sci. USAJ，1996,93:6851.采用ESI-TOF-MS对4OT酶低聚构造进行分析、测试，成果表白在溶液中其以六聚体存在，这和以往X-Ray衍射成果一致。对Silurus Asotus Roe Lectin(SAL)ESIMS测定表白SAL单体分子量为31
16、 750Da，而沉淀平衡法测定分子量为95 200Da。由此可以阐明该蛋白质在溶液中以三聚体形式存在。经基质辅助激光解吸飞行时间质谱测定验证了这一推断Murayama K，Taka H，Kaga N，et al. Anal. BiochemistryJ，1997,247:319.。Lafitte对钙调节蛋白在溶液中及变性条件下蛋白质聚合体研究与超离心测定成果一致36Lafitte D，Heck A J R，Hill T J，et al. Eur. J. BiochemJ. ，1999,261(1)：337.3.2 蛋白质和配体MS用于配体-蛋白质非共价作用研究最初关注于完整亚铁血红素-肌血球素化合物40及完整复合FK结合蛋白（FLBP）61，后者为免疫抑制结合蛋白，可与免疫抑制剂FK506、rapamycin结合。非共价ESI-M
