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1、第四章：脊髓损伤的干细胞治疗第一节、干细胞概述干细胞是存在于胚胎和成体中的一类特殊细胞，它能长期地自我更新，在特定的条件下具有分化形成多种终末细胞的能力。干细胞研究自1967年第一次用于骨髓移植治疗造血功能障碍起,直至1998年美国成功地在人类胚胎干细胞体外培育后,才使干细胞研究上了一个新台阶。为此,1999年美国科学杂志把干细胞研究列为21世纪的10项最重要的研究领域之首,位于破译人类基因组计划之上。干细胞领域的新知识和研究方法的不断涌现最终将产生针对脊髓损伤、肿瘤、心脏病、糖尿病，以及影响人类健康的许多其他疾病的崭新的治疗手段。科学的历史已经证明，关于干细胞的研究最终将为人类健康带来无限的
2、益处，最终我们将构建出新的、可供安全移植到患者体内的器官，而干细胞的研究无疑会为这项突破作出巨大贡献。 干细胞是指同时兼具自我更新能力和产生分化细胞能力的一类细胞，这类细胞可经培养进行不定期分化并产生特化细胞。依据分化潜能的大小，可将干细胞分为3种类型：一是单能干细胞(也称专能干细胞)，这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如神经干细胞；二是全能干细胞，此类细胞具有分化为完整个体的能力，如胚胎干细胞；三是多能干细胞，这类细胞具有分化为多种细胞组织的潜能，但不具备发育为完整个体的能力，如骨髓间充质干细胞。【3】初步研究表明：在脊髓中移植入这些全能干细胞或多能干细胞后，能够在宿主
3、体内存活、迁移、与宿主组织整合，并可根据所处的局部环境发生分化，一般先分化成神经元祖细胞和胶质祖细胞，然后再分化成神经元和胶质细胞，科学家希望移植的干细胞可替代损伤、死亡的神经元，重建神经元回路，并在损伤部位的近端和远端间起连接中断作用。此外，还希望可通过基因修饰使干细胞表达外源性基因，然后将其移植到受损部位，使它们分泌大量的治疗性神经营养因子，以防止神经元死亡并促进神经再生。第二节 干细胞治疗脊髓损伤的机理脊髓损伤的病理机制：脊髓损伤后，血脊髓屏障被破坏，局部缺血，缺氧，多种炎性因子进入损伤区域，触发细胞坏死和凋亡等级联效应。在损伤残存的神经细胞的同时，还会造成脊髓创伤区边缘脊髓组织的损伤，
4、因此预防继发损伤是早期治疗的重要内容。从病理生理机制角度分析，脊髓损伤后出现的局部微环境改变也是造成神经系统再生失败的重要原因。脊髓损伤后局部微环境的变化包括：损伤造成神经细胞死亡，脊髓屏障破坏造成脊髓内环境失衡。细胞毒性物质造成缺血再灌注损伤。损伤后多种抑制性因子表达于细胞表面。反应性胶质细胞大量增殖，所形成的胶质瘢痕及再生抑制分子阻止了轴突再生和跨越损伤区【1】。干细胞的选择及治疗脊髓损伤的机理：NSC可通过以下几方面修复脊髓损伤：（1）NSC及分化后产生的神经元和胶质细胞可以分泌多种神经营养因子，改善损伤脊髓局部微环境，促进轴突再生，同时它们还能产生多种细胞外基质填充脊髓损伤后遗留的空腔
5、，为轴突的再生提供支架；（2）补充缺失的神经元和胶质细胞；（3）使残存脱髓鞘的神经纤维髓鞘化，以恢复神经纤维结构的完整性。MSCs移植治疗脊髓损伤的临床显效的机理可能包括以下几个方面，(1)单核巨噬细胞侵入损伤部位并对坏死组织发挥吞噬作用；(2)促进局部新生血管生成和血管重建，改善神经营养；(3)神经再生，包括促进自体神经细胞再生和移植细胞定向分化为神经细胞两个方面。骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的基础：骨髓间充质干细胞可作为填充物填补损伤部位，定向再生为神经细胞锚靠周围组织完成上行下传功能的重建，移植时创造抑制胶质细胞再生、保护神经细胞胞体存活、促进自体神经细胞再生的微环境。【5】胚胎干细
6、胞是来源于胚泡分化5 d后的内细胞团，最早用于治疗脊髓损伤。在一定条件下，ES细胞可诱导分化成为神经前体细胞及有生理功能的神经细胞，当移植到健全或损伤的中枢神经系统后，可以与宿主细胞整合，修复重建损伤的神经组织。同时脊髓损伤的环境除了产生某种细胞因子刺激ES迁移外，同时也能使ES存活，并按微环境的诱导，分化成为神经细胞，分泌相关细胞因子，以继续促进损伤脊髓功能的恢复，防止继发性脊髓损伤的发生。胚胎神经干细胞替代损伤、死亡的神经元，重建神经元回路是有作用的，并在损伤部位的头端和尾端间起中断作用。但这些细胞移植入宿主体内后除分化成神经前体细胞外，还能分化成多种其他类型的前体细胞，使移植部位容易形成
7、类似畸胎瘤的副产品【8】，并且ES细胞涉及到伦理学、法律以及组织相容性和胚胎的来源问题，其临床应用目前还受到限制。反观MSCs，其来源广泛，取材方便，分离培养容易，且MSCs易于外源基因的导入和表达，可为基因治疗神经系统的疾病提供良好的载体。患者可以利用自身的MSCs体外培养扩增，用于脊髓损伤的治疗，恢复神经系统的正常功能，由于MSCs取自自体，由它诱导而来的神经细胞在进行移植时不存在组织分型及免疫排斥问题，也无ES的伦理道德问题。第三节、干细胞在脊髓损伤的临床应用指征及临床应用效果和评估随着交通及建筑事业的发展，全球脊髓损伤（Spinal Cord Injury, SCI）的发病率有逐年增加
8、的趋势，根据近年的统计，SCI在英美两国的年发病率分别为12人/百万人口和30-32/百万人口，全世界SCI每年发生率是15-40例/百万。由于神经组织的自我修复能力非常有限，脊髓损伤后造成的神经功能障碍很难恢复，大多数SCI患者遗留完全性或不完全性的“四瘫”或“截瘫”，生活不能自理，给家庭和社会带来巨大的经济负担。而目前公认的大量激素在急性期脊髓损伤的冲击疗法确是可以明显改善受损神经功能后期恢复，但是由于激素的副作用和其严格的治疗时间窗，使其治疗受到很大的限制。近年来随着干细胞研究的进展，干细胞不仅可以在体外扩增，其在特定的条件下还能分化成各种成体细胞并且维持其在体内的部分生物学特性，因此干
9、细胞移植治疗脊髓损伤成为可能。近20年来随着神经生物学的飞速发展，尤其是在细胞和分子水平上对脊髓外伤后继发性损伤的病理机制和干细胞的研究不断深入，使得人们对攻克脊髓损伤越来越充满信心。在治疗脊髓损伤的实验和临床研究中，研究者采取了一系列干预措施，就目前的资料看，骨髓干细胞是比较理想的移植材料。实验表明在动物脊髓损伤的模型中，神经干细胞能根据移植部位的内环境进行相应的分化，并与宿主组织相结合，替代部分坏死细胞，重建神经环路，为损伤部位以下正常组织提供旁路中继站，获得功能恢复。Sykova等【6】将自体骨髓间充值干细胞移植入7例急性脊髓损伤和13例慢性脊髓损伤的患者体内，采用ASIA评分、Fran
10、kel评分，记录运动和感觉诱发电位以及MRI等方式做为观察指标，随访2年，认为骨髓干细胞移植安全、有效，且干细胞移植的最佳时间在脊髓损伤后第9d左右，此时局部的微环境比较适合神经干细胞的生长和分化【4】。Moviglia等【7】报道了骨髓干细胞治疗2例慢性脊髓损伤的初步临床结果，移植后并接受vojta和Bobath神经康复，1例19岁男性T8节段截瘫患者，6个月后运动平面恢复到S1，感觉平面恢复到S4水平；另1例为21岁女性C3，5水平损伤，治疗前为四肢瘫，治疗6个月后运动和感觉平面恢复到T5水平。对于干细胞治疗脊髓损伤的移植方式，目前国内外文献报道大体有3种：（1）脊髓损伤部位原位移植在脊髓
11、损伤手术治疗中，将干细胞直接移植到损伤区周围，可促进神经细胞功能的改善和恢复。但要把握手术时机并不太容易，尤其是急诊手术。（2）脑脊液途径移植可选择合适时机进行千细胞移植，通过椎体穿刺将于细胞注入脑脊液中，干细胞会迁移至脊髓损伤部位并修复受损的神经细胞。此种方法简便易行，可重复性好。（3）静脉途径移植willing等对短暂大脑中动脉闭塞的大鼠模型比较股静脉和纹状体两种移植方式时发现，经股静脉移植较纹状体内移植对大脑中动脉阻塞(MCAO)的功能恢复更有效。对于SCI是否如此还有待进一步证实。【2】Paul C等【10】通过对比实验证实腰椎穿刺移植MSCS的效果优于静脉注射，其宿主免疫反应也明显弱
12、于静脉。而局部移植虽然单论效果要好于以上两种，但是MSCS要部分趋化到损伤组织，相对降低了MSCs的临床疗效，故局部注射应尽量减少创伤。其疗效视创伤大小而定。本院于2004年开始把骨髓干细胞应用于临床研究和治疗，对于神经系统变性病基本上达到了阻止和延缓疾病发展的目的，随着对骨髓干细胞认识的深入，针对损伤节段的不同和损伤的轻重程度以及是否存在椎管狭窄采取的移植术式是不同的，对于有些病例如S25平面神经损伤，基本上达到了临床治愈的目标，即使高位截瘫如颈5-8损伤的病例，治疗后神经功能取得了长足的进步，其他许多病例取得了感觉平面的下移，尿便功能的恢复，本体感觉的恢复，病理征的恢复等，其中有5例急性脊
13、髓锐器伤和13例慢性脊髓锐器伤的病例，神经功能恢复尤为突出。到目前已治疗脊髓损伤患者100余例，具体治疗过程如下：患者入院后反复告之骨髓干细胞治疗的可行性和可能存在的风险性，在患者完全知情同意的条件下，常规检查身体各种状况以评价是否适合于行干细胞移植。当检查合格后，结合干细胞特点，干细胞移植疗程如下：第1次是在在局部麻醉下做髂后上棘自体骨髓血采集，采集自体骨髓血约200 mL，在实验室经1周左右的分离扩增，然后依据病变部位的不同采取不同的干细胞移植方式。一般来讲，首先通过手术或立体定向的方法把千细胞直接移植在神经损伤或变性部位，然后再根据病情经腰穿途径或经静脉途径移植，每次治疗间隔为1周。在此
14、过程中为促进干细胞的生长和分化，根据病情及个人身体状况的不同，给予康复功能锻炼，包括：PT和OT治疗；针灸、高压氧以及药物营养神经和改善微循环治疗。从临床实践和临床统计中得出：干细胞治疗脊髓损伤，是可行的、有效的、有发展前途的。【9】参考文献【1】Alexander GRGeorge MSTherapeutic interventions foIlowing mammalian spinal cord iniuryArch NeuroI 200l；58(5)：721726【2】杨晓凤.干细胞治疗脊髓损伤的研究现状. 中国实用内科杂志2007年5月第27卷第10期 1005-2194（2007）
15、10-0741-03【3】朱晓峰神经干细胞基础及应用【M】北京：科学技术出版社，2005：18-28【4】Nakamura M，Toyama YTransplantation of neural stem cellsinto spinal cord after injuryNippan Rinsho，2003，61(3)：463【5】步星耀 张永福. 骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤. 实用诊断与治疗杂志2004年第18卷第4期. 1672-3457(2004)04-259-03【6】Svkova E，HamoIa A，Mazanec R，et a1AutoIogous bone marrow
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