免疫荧光抗的选择

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1、免疫荧光抗的选择免疫组化/western blot/免病荧光如何进行二抗的选择2010-05-26 17:20:12| 分类： 默认分类 |字号 订阅 在讲二抗的选择之前，我们有必要对抗体(也就是免疫球蛋白)的基本结构等基本知识进行必要 的了解。免疫球蛋白，包括 IgA, IgD, IgE, IgG 和 IgM 五种，其各自来源及特点如下：NameTypesDescriptionIgA2Found in mucosal areas, such as the gut, respiratory tract and urogenital tract, and prevents colonizatio

2、n by pathogens. Also found in saliva, tears, and breast milk.IgD1Functions mainly as an antigen receptor on B cells that have not been exposed to antigens. It has been shown to activate basophils and mast cells to produce antimicrobial factors.IgE1Binds to allergens and triggers histamine release fr

3、om mast cells and basophils, and is involved in allergy. Also protects against parasitic worms.IgG4In its four forms, provides the majority of antibody-based immunity against invading pathogens. The only antibody capable of crossing the placenta to give passive immunity to fetus.IgM1Expressed on the

4、 surface of B cells and in a secreted form with very high avidity. Eliminates pathogens in the early stages of B cell mediated (humoral) immunity before there is sufficient IgG.其中，IgD, IgE, IgG是单体结构，IgA是二聚体结构，IgM是五聚体结构各种抗体共同的基本结构都包括2条轻链和2条重链，Fab和Fc段如图所示Schematic diagram of the basic unit of immunogl

5、obulin (antibody)FabFcheavy chain (consist of VH, CH1, hinge, CH2 and CH3 regions: from N-term)light chain (consist of VL and CL regions: from N-term)antigen binding sitehinge regions(*) -S-S- mean disulfide bonds.通过以上的阅读，我们已对抗体的基本结构了解了，接下来我们便来谈谈如何选择二抗了。1. 确定你一抗的种属来源，此处要与种属反应性相区别。种属来源在英文中也即 host Spe

6、cies， 就是抗体从什么动物体内获得的；种属反应性即 reactivity species, 比如我们的实验标本是小鼠， 我们买的一抗必然是抗小鼠的，那么小鼠便是抗体的种属反应性；但该抗体有可能是兔抗小鼠或 者羊抗小鼠，那么这里的兔或羊便是一抗的种属来源。以兔抗小鼠为例2. 确定你一抗的类型，一般是 IgG, 但也有 IgM 等类型，以 IgG 为例3. 根据以上两点,我们便可以判定本例中我们要买的二抗便是抗兔的 IgG4. 二抗的标记物：这要根据你的应用了，一般有HRP, AP, BIOTIN,各种荧光素如FITC等等。5. 拉下来，出现了更复杂的问题，我们查试剂公司的目录，发现即使是同一

7、种标记物如 HRP，二抗的种类也太多了，有 Anti-IgG (H+L) Anti-IgG (Fc chain)， Anti-IgG-F (ab) 2, Anti-IgG (Fab) 等。具体有以下几种,我们在此详细讲一下：先看一下图，以IgG为例，IgG经木瓜蛋白酶消化后，形成了 Fc片段和2个独立 的 Fab 片段,再看一下幅图，以IgG为例，IgG经胃蛋白酶消化后，形成了 Fc片段和F(ab)2片段，从图中 可以看出 F(ab)2 是指两个 Fab 片段连在一起。lAnti-IgG，Fc fragment specific此种抗体只和IgG重链的Fc片段反应，每一种抗体均经过抗F (ab

8、*)的吸收。有些抗体还另外进行了去除IgM和IgA的吸收处理，这种抗体的标记为 “Anti-IgG(Fc)”1 Anti-IgG, F (ab) 2 fragment specific 此种抗体只和 F (ab) 2/Fab 反应，因为 F (ab)2 包含免疫球蛋白的轻链，所以此抗体会和含有相同轻链的其它抗体反应。lAnti-IgG (H+L )此种抗体可以和IgG分子的重链和轻链同时反应，即与F (ab和Fc均可反应，同时因为所有的免疫球蛋白都有相同的轻链(k或I),所以也可识别同一种属的其他 类的免疫球蛋白，如IgM、IgA等。都明白以上的意思了吧，那么，我们还需再回过头来，看看我们的一

9、抗抗体是整个IgG抗体分子” 还是抗体分子的 F(ab 片段或 Fab 片断，这样便要根据不同的情况来选择我们的二抗了，具 体如下：Anti-IgG(H+L Anti-IgG (Fc chain)， Anti-IgG-F(ab2， Anti-IgG(Fab 这四种二抗，后两者由于去除了抗体的Fc段，可以避免与细胞表面的Fc受体结合而干扰检测结果。可采用二抗来源 的动物血清进行封闭，也可封闭Fc受体。但需要注意的是千万不要用一抗来源的动物血清作为 封闭液。另外，针对某一种属的抗体可能会和其他一些种属有交叉反应。牛血清白蛋白和奶粉可能含有与 抗牛IgG、抗山羊IgG、抗马IgG、抗绵羊IgG等抗体

10、反应的IgG，因此如果使用它们作为封闭液 或抗体稀释液的成分，会增加背景染色和降低抗体的效价。上句话有点难明白哈，简单点说就是， 如果用的是抗牛IgG、抗山羊IgG、抗马IgG、抗绵羊IgG的二抗，那么封闭过程中就尽量不要用 牛血清白蛋白和奶粉，以免交叉反应造成背景染色增加和抗体效价降低。6, 等会，还没完事呢，还有一些复杂的，那就是IgG的亚型了，比如说我们想买一支HRP标记 的羊抗大鼠的二抗，搜索出来一看，这么多，如下：Goat anti-Rat IgG1 Antibody HRP ConjugatedGoat anti-Rat IgG2b Antibody HRP ConjugatedGoat anti-Rat IgG2c Antibody HRP Conjugated这就又提醒我们，还一定要注意一抗抗体的 IgG 亚型。