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1、肝内胆管结石并肝内胆管癌组织中HSP27和Caspase-9的表达及与凋亡的关系【摘要】目的：探讨肝内胆管结石并肝内胆管癌组织中HSP27和Caspase-9的表达及与凋亡的关系。方法：选取我院于2010年10月至2013年10月间收集的病例资料和手术切除标本60例作为研究对象，并将其分为三组，A组正常胆管组12例，B组肝内胆管结石组28例，C组肝内胆管结石并肝内胆管癌组20例。通过免疫组织化学法分别对三组的HSP27与Caspase-9 的表达情况进行检测，并研究分析HSP27和Caspase-9与细胞凋亡之间的关系。结果：三组标本的HSP27和Caspase-9的表达阳性率分别为0、32.
2、14%（9/28）和75.00%（15/20），C组明显高于其他两组(P0.05)，肝内胆管结石并肝内胆管癌组织中，HSP27和Caspase-9的表达呈负相关关系（r=-0.378，P=0.020）；三组的凋亡指数（apoptosis index，AI）分别为12.652.16%、14.263.77%、3.682.71%，A、B两组的 AI值明显高于C组P0.05）结论： HSP27的高表达或 Caspase-9的低表达都更容易造成淋巴结转移或门静脉浸润的现象，Hsp27能够通过抑制Caspase-9的活性从而抑制细胞凋亡。【关键词】肝内胆管结石；肝内胆管癌组织；表达与凋亡Expressio
3、n of HSP27 and Caspase-9 and its relationship to apoptosis in hepatolithiasis associated intrahepaticAbstract Objective: To investigate the expression of HSP27 and Caspase-9 and its relationship to apoptosis in hepatolithiasis associated intrahepatic. Methods: The clinical data of 60 cases between O
4、ctober 2010 to October 2013 was analyzed in our hospital, and the 60 cases were divided into three groups, A group:normal bile duct group (12 cases), group B:liver group with bile duct stones (28 cases ), group C:group with intrahepatic bile duct stones intrahepatic cholangiocarcinoma (20 cases ). H
5、SP27 expression and Caspase-9 of three groups were detected by immunohistochemistry, respectively, and to study and analyze the relationship between HSP27 and apoptosis Caspase-9 between. Results: HSP27 and positive expression rate of the three groups of specimens Caspase-9 was 0,32.14% (9/28) and 7
6、5.00% (15/20), respectively, group C was significantly higher than the other two groups (P 0.05).The expression of HSP27 and Caspase-9 was negatively correlated with liver bile duct stones and intrahepatic cholangiocarcinoma tissues, (r = -0.378, P = 0.020); three groups of apoptotic index (apoptosi
7、s index, AI) was 12.65 2.16 %, 14.26 3.77%, 3.68 2.71%, AI value of group A and B was significantly higher than group C P 0.05）。免疫组化半定量诊断标准按无色、淡黄色、棕黄色、棕褐色等四种类别分别记为03分；按占切片总细胞数的比例分别记为04分。将两项分数相乘，所得积分为四个几倍，0分为“-”阴性，l-4分为“+”弱阳性，5-8分为“+”阳性，9-12分为“+”强阳性。1.1.2实验试剂与实验仪器 羊抗人HSP27免疫组化多克隆抗体(ZS-1048，浓缩型0.1ML)、
8、兔抗人Caspase-9免疫组化多克隆抗体(ZS-8355，浓缩型0.1ML)、即用型免疫组化试剂盒等购于南京碧波生物技术有限公司。其他试剂包括纯二甲苯、PBS 缓冲液、苏木素复染液等取自于我院中心试验室。 主要实验仪器包括光学显微镜 BX60、生物组织自动包埋机（TB-718D2）、切片机（AS325）、全自动生物组织脱水机（ZT-12J）、病理组织漂烘仪（PHY-）、染色架、微量移液器、YPS 病理图文分析管理软件等，取自于我院中心试验室。1.2方法 免疫组织化学检测(SP法)的具体步骤如下，首先将4m厚的石蜡标本块经过连续切片处理后，将其放置在温度为60恒温箱中进行烤片30min；然后将
9、常规纯二甲苯溶液依次经不同浓度的梯度酒精水化各5min，再以PBS缓冲液进行漂洗处理；使檬酸盐缓冲液进经微波抗原修复，在高火档微波内持续复原10分钟，在保证切片快速冷却后再及时取出，并置于37C的恒温箱中30min；向切片滴加羊抗人 HSP27免疫组化多克隆抗体和兔抗人 Caspase-9免疫组化多克隆抗体后置于恒温为4的冰箱过夜；第二天经PBS缓冲液冲洗后进行二次滴加，以苏木素复染2min后观察结果，对图像进行采集。 TUNEL细胞凋亡原位检测的具体步骤与SP法的具体步骤相类似，石蜡切片经过滴加蛋白酶K工作液后置于37C的恒温箱中30min，以PBS缓冲液漂洗之后，将切片浸入封闭液中。再讲切
10、片取出，周围用滤纸吸干，滴加50ul的TDT酶反应液，以荧光显微镜来观察并计数细胞的凋亡情况，对图像进行采集。1.3统计学处理 应用SPSS17.0软件，HSP27、Caspase-9 的表达关系用2检验；凋亡指数用均数标准（xs）表示，组间比较用t检验、多个样本均数的比较采用方差分析；规定P0.05 为差异显著，具有统计学意义2。2.结果2.1 HSP27与Caspase-9 在不同胆管组织中的表达 三组中HSP27的表达阳性率分别为0、32.14%（9/28）和75.00%（15/20）。C组HSP27的蛋白表达主要定位于细胞浆，染色呈棕黄色或黄色。本研究中20例肝内胆管癌组织有15例 H
11、SP27蛋白表达呈阳性，明显高于A、B两组，差异显著，具有统计学意义(P0.05)。具体详见下表1。表1 HSP27 在不同胆管组织中表达情况对比组别例数HSP27阳性率-+A组12120000.00%B组281954032.14%C组20538475.00% 三组中Caspase-9 的表达阳性率分别为83.33%（10/12）、71.43%（20/28）和30.00%（6/20）。Caspase-9的蛋白表达主要定位于细胞浆，染色呈棕黄色。本研究中20例肝内胆管癌组织的胞浆中仅有6例表达呈阳性，明显低于A、B两组，差异显著，具有统计学意义(P0.05)。具体详见下表2。表2 Caspase
12、-9 在不同胆管组织中表达情况对比组别例数Caspase-9阳性率-+A组12235283.33%B组288610471.43%C组201442030.00%C组患者的HSP27 与Caspase-9 蛋白表达的相关性经Pearson 相关性分析，结果见表3，呈负相关表3 HSP27、Caspase-9 与肝内胆管结石并肝内胆管癌的相关性HSP27例数Caspase-9阳性阴性例数百分率（%）例数百分率（%）阳性15213.331386.67 阴性5480.00120.00合计20630.001470.00注：Pearson分析（r=-0.378，P=0.020）。2.2三组凋亡指数比较在正常胆管组12例、肝内结石所在胆管组28例、肝内胆管结石并肝内胆管癌组20例组织中，A、B两组的 AI值明显高于C组，差异显著，具有统计学意义（P0.05）。具体各组凋亡指数详见下表4。表4 细胞凋亡在不同胆管组织之间的对比组别例数细胞凋亡指数（%）A组1212.652.16B组2814.263.77C组203.682.713.讨论 肝胆管结石病是临床诊治中常见的疾病，该疾病经过一系列病理变化之后导致癌变，严重影
