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1、常用设备准备室的设备：单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品规（放置消毒过的物品）、包装台。配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。培养室的设备：液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4冰箱（放置serum和培养用液）。无菌操作无菌室的灭菌：1、定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水
2、拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3来苏尔或者新洁尔灭或者0.5过氧乙酸擦拭。2、CO2孵箱（培养箱）灭菌：先用3新洁尔灭擦拭，然后用75酒精擦拭或者0.5过氧乙酸，再用紫外灯照射3、实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟4、实验后灭菌：用75酒精（3新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。实验人员的无菌准备：1、肥皂洗手。2、穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋3、用75酒精棉球擦净双手。无菌操作的演示：1、凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75酒精擦拭瓶子的外表面2、靠近酒精灯火焰操作。3、器皿使用前必须过火灭菌4、继续使
3、用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。5、各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。6、吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。器械的清洗和消毒玻璃器械洗消：一、新的玻璃器皿的洗消：1、自来水刷洗，除去灰尘。2、烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。3、刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。4、泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水1000ml）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过
4、3次。5、烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。6、高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。7、高压消毒后烘干二、旧的玻璃器皿的洗消：1、刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。2、泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液），12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗3次。3、烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止
5、灰尘和再次被污染。4、高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出3-5分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向15磅时，调节电开关维持20-30分钟即可。（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上）5、烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。金属器械洗消：金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压（30分钟）消毒，再烘干备用。橡胶和塑料：橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂
6、洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序：1、针式滤器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上(凹向上)，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒，再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。2、胶塞烘干后用2氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞只要用沸水处理30分钟），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。3、胶帽，离心管帽烘干后只能在2氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时（
7、切记时间不能过长），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。4、胶头可用75酒精浸泡5分钟，然后紫外照射后使用即可。5、塑料培养瓶，培养板，冻存管：6、其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用70酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用23周时间洗除残留的氧化乙烯。用20000100000rad的r射线消毒塑料制品效果最好。为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸包装后，用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨
8、水，在包装纸上作一记号，平时_这种墨水不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制：氯化钻(CoC126H2o)2g，30盐酸10m1，蒸馏水88m1。细胞培养用液的配制与消毒器材与试剂：干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。具体步骤：一、水的制备：细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水二、PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)：1、溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4H2O 1.56g，KH2PO4
9、0. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。2、移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。三、胰蛋白酶溶液的配制与消毒：胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2
10、+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。1、称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。搅拌混匀，置于4内过夜。2、用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20保存以备使用。四、青、链霉素溶液的配制于消毒1、所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。2、具体操作均在超净台内完成。
11、青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。3、使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。1单位1微克？五、RPMI1640的制备与消毒：1、溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用一个当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。最后定容至1000ml，摇匀。2
12、、安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。3、抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。4、分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4冰箱内待用。5、使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4时两周有效）。六、血清的灭火：细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56水浴中灭火30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。七、HEPES溶液：HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N-a-hydroxythylpiperazine-N- ethanesulfanic acid ）
13、。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L，一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下：准确称取HEPTS 238.3g，加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌，分装后4保存。注意：因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20m mol/L 。如：称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，过滤除菌后可完全（20ml）加入1L培养液中，或者每100ml培养液中加入2ml即可。八、谷氨酰胺：合成培养基中都
14、含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4下放置1周可分解50，故应单独配制，置于-20冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。一般培养液中谷氨酰胺的含量为14mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20保存，使用时可向100ml培养
15、液中加入1ml谷氨酰胺溶液。九、肝素溶液的配制：含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为0.56克/瓶，配制时，可将其溶于100ml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为。使用时，向100ml培养液中加入1ml（精确可加入0.9ml）即可。十、型胶原酶：0.1型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20保存。十一、明胶溶液：因为明胶难于过滤，所以配制0.1明胶溶液必须用无菌的PBS配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量0.1克（配成100ml溶液）即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是01.的溶液，明胶也难溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌分装入50ml小瓶中， 4保存。其他培养用液的配制：20ug/ml内皮生长因子，注意事项：1、配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。2、安装蔡式滤器时通常使用孔径0.45微米 和0.22微米滤膜各一张，放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。3、配制RPMI1640培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液PH
