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1、 .wd. 本科生毕业论文题 目： 酶辅助法提取藕节中总黄酮初探 专 业： 化学 姓 名： 学 号： 指导教师： 职称： 论文字数： 5700 完成日期: 2012 年 5 月教 务 处 印 制目 录摘要I关键词IAbstract.IIKey words.II前言11 实验局部21.1原料、试剂与仪器21.1.1原料21.1.2试剂21.1.3仪器21.2 实验方法21.2.1样品的制备21.2.2黄酮的定性实验21.2.3芦丁标准溶液的配制21.2.4测定波长的选择21.2.5芦丁标准曲线的绘制31.2.6提取工艺流程31.3单因素实验31.3.1酶浓度的影响31.3.2酶解温度的影响31.
2、3.3 酸碱度的影响31.3.4酶解时间的影响31.4正交实验31.5乙醇回流法提取藕节中的总黄酮32结果与分析42.1黄酮的定性实验结果42.2测定波长的选择42.3芦丁标准曲线的绘制结果42.3.1芦丁标准曲线的绘制42.3.2总黄酮得率计算52.4单因素实验结果52.4.1酶浓度对藕节中总黄酮得率的影响52.4.2酶解温度对藕节中总黄酮得率的影响62.4.3酸碱度对藕节中总黄酮得率的影响62.4.4酶解时间对藕节中总黄酮得率的影响72.5正交实验结果72.6乙醇回流法提取藕节中的总黄酮实验结果83结论与讨论8参考文献9致谢10酶辅助法提取藕节中黄酮的初探摘要：本论文尝试酶辅助法提取藕节中
3、的总黄酮。通过单因素实验初步探究了酶浓度、酶解温度、pH值、酶解时间四个实验条件对于藕节中总黄酮得率的影响。通过L934的正交实验最终确定了藕节中总黄酮提取的最正确实验条件。实验结果说明：70%乙醇作提取剂时，酶浓度为0.20mg/mL，酶解温度为55，pH值为5.0，酶解时间为2.5h为最正确提取条件，最终测定的藕节中黄酮得率为2.714%。与乙醇回流提取相比藕节中总黄酮得率提高了12.8%，说明酶辅助法有一定的优异性。关键词：纤维素酶解法；乙醇回流；藕节；黄酮；单因素实验；正交实验Enzyme assisted extraction of total flavonoids from lot
4、usAbstract: Enzyme assisted extraction of total flavonoids from lotus are reported in this paper. The single factor experiment preliminarily investigated the enzyme concentration, hydrolysis temperature, pH value, hydrolysis times on the influence of extraction rate of the total flavonoids, Finally,
5、 orthogonal experiment of L934was designed to determine the optimum conditions for enzyme assisted extraction of total flavonoids from lotus. The experimental results indicate that: 70% ethanol as extractant, the enzyme concentration for 0.20 mg/mL, hydrolysis temperature was 55oC, pH value of 5.0,
6、the hydrolysis time was 2.5h, the extraction rate of total flavonoids reaches the maximum value of 2.714%. Compared with ethanol refluxing extraction yield of flavonoids in lotus12.8%, indicating enzyme assisted method has certain superiority.Key words: Enzyme assisted; ethanol reflux; lotus; total
7、flavonoids; single factor experiments; orthogonal experiment; extraction rate.酶解法提取藕节中黄酮的初探前言黄酮类化合物又称生物类黄酮，是存在于自然界的一大类化合物。许多研究说明，生物黄酮具有多种生物活性，如抗菌、消炎、抗突变、降压、清热解毒、改善微循环、抗肿瘤等成效，其抗氧化作用也被人们所重视1，提取植物中的黄酮类化合物是有价值的。目前已掌握的提取黄酮的方法有：传统提取方法有机溶剂提取、热水提取、碱性水或碱性稀醇提取、系统溶剂提取，超声波提取法，微波提取法，酶解法，超临界流体萃取法，半仿生提取法2。2005年，余美
8、料，陈镇，黎海妮等人用蒸馏水浸提法提取莲藕中的总黄酮，最终测得总黄酮得率1.133。2009年，姚晓琳，朱新荣，段春红等人采用酶解法提取甜橙皮中的黄酮，所得的最正确工艺条件为pH值4.0，酶解温度60，酶浓度5，酶解时间2.5 h，料液比120，乙醇浓度80；黄酮的提取率可达2.670.064。2011年，许金蓉，王满章以鄂莲系列为材料，以甲醇为提取剂在80水浴条件下用索氏提取法提取不同品种莲中的总黄酮，并对其含量分布进展了研究，得出同一地下茎的藕节中总黄酮的含量明显高于其他局部，藕节中总黄酮含量最高的鄂莲1号，其含量为23.0mg/g的结论5本课题研究从干藕节粉末中提取黄酮类物质。在我所查验
9、的文献中尚未发现用酶辅助法提取藕节中的总黄酮，先采用纤维素酶分别在不同的酶浓度、酶解温度、PH值及酶解时间条件下酶解，再用70%乙醇在85水浴条件下回流提取，并用722型可见分光光度计测定提取液中黄酮含量，在最正确单因素范围内设计正交实验，选出较优的提取工艺，进而为从藕节中黄酮的提取提供一定的实验数据参考。1 实验局部1.1原料、试剂与仪器1.1.1原料干藕节楚雄同济堂一中店、产地昆明1.1.2试剂蒸馏水、无水乙醇广东光华科技股份、氯化铝天津市科密欧化学试剂、盐酸成都市科龙化工试剂厂、亚硝酸钠天津市风船化学试剂科技、硝酸铝天津市科密欧化学试剂、三氯化铁、氢氧化钠广东光华科技股份、锌粉、氨水成都
10、市科龙化工试剂厂，除蒸馏水外以上试剂皆为分析纯。纤维素酶上海埃博商贸，规格30u/mg、芦丁标准品日本和光纯药工业株式会社。1.1.3仪器722型光栅分光光度计山东高密彩虹分析仪器；CP214c电子天平(奥豪斯仪器上海)；HH-S2s恒温水浴箱金坛市大地自动化仪器厂； J1050型托盘天平浙江省岱山中学天平仪器厂；DFY-500 500克摇摆式高速中药粉碎机温岭市林大机械；电热鼓风恒温枯燥箱上海市崇明实验仪器厂；回流装置和玻璃仪器。1.2 实验方法1.2.1样品的制备药店购置藕节，去除泥土等杂质，粉碎，恒温枯燥105，备用。1.2.2黄酮的定性实验6盐酸锌粉反响 用台秤称取2.0 g样品置于1
11、00 mL圆底烧瓶中，参加40 mL 70%V/V乙醇，回流1 h过滤，用吸量管取1.00 mL滤液于试管中，往试管中参加少许锌粉，再滴加几滴浓盐酸，振荡混匀，观察现象必要时微热。铝盐反响 用吸量管取上述滤液1.00 mL于试管中，再往试管中用吸量管加1.00 mL 10%氯化铝溶液，观察现象。三氯化铁反响 用吸量管取上述滤液2.00 mL于试管中，往试管中用吸量管加1.00 mL 5%三氯化铁溶液，观察现象。1.2.3芦丁标准溶液的配制7用电子分析天平准确称取充分枯燥105的芦丁10.0 mg于小烧杯中，用70%的乙醇溶解。将溶液转移至50 mL容量瓶中，用少量70%乙醇洗涤烧杯和玻璃棒23
12、次，并将洗涤液全部转移到容量瓶中。轻轻振荡容量瓶，使溶液混合均匀；再用70%乙醇定容至刻度线，摇匀静置，备用。1.2.4测定波长的选择用吸量管准确取上述芦丁标准液6.50 mL于50 mL容量瓶中，参加20 mL 70%乙醇溶液，再用吸量管准确参加0.40 mL 5%的亚硝酸钠混匀，静置6 min；用吸量管准确参加0.40 mL 10%硝酸铝，静置6 min；再用吸量管准确参加4.00 mL 1 mol/L氢氧化钠混匀，用70% 乙醇定容摇匀，静置10 min ；以试剂空白作参比，在波长470530 nm之间测定吸光度，确定最大吸收峰波长。1.2.5芦丁标准曲线的绘制分别用吸量管取上述芦丁标准
13、液0.00、0.50、1.50、2.50、3.50、4.50、5.50、6.50mL于50 mL容量瓶中，用吸量管准确参加0.40 mL 5%的亚硝酸钠混匀，静置6 min；用吸量管准确参加0.40 mL 10%硝酸铝，静置6 min ；再用吸量管准确参加4 .00 mL 1 mol/L氢氧化钠混匀，用70% 乙醇定容摇匀，静置10 min ；以试剂空白为参比，在1.2.4确定的最大吸收波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，芦丁标准液浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程。1.2.6提取工艺流程藕节粉乙醇回流过滤洗涤定容测定藕节粉酶解乙醇回流过滤洗涤定容测定1.3单因素实验81.3.1酶浓度的影
14、响取6个100 mL的圆底烧瓶，分别参加2.0 g藕节粉，再分别准确参加12.00 mL浓度为0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.15 mg/mL、0.20 mg/mL、0.25 mg/mL、0.30 mg/mL的纤维素酶溶液，用稀盐酸调节pH为5.0，在50恒温水浴中酶解1.5 h；再分别参加28mL无水乙醇回流提取1 h，过滤，洗涤滤渣，收集滤液，用70%乙醇溶液定容至50 mL摇匀，备用。 1.3.2酶解温度的影响取6个100 mL的圆底烧瓶，分别参加2.0g藕节粉，再分别准确参加12.00 mL 0.15 mg/mL纤维素酶溶液，用稀盐酸调节pH为5.0，在40、45、50、55、60、65恒温水浴中酶解1.5 h；再分别参加28 mL无水乙醇回流1 h，过滤，洗涤滤渣，收集滤液，用70%乙醇溶液定容至50 mL摇匀，备用。 1.3.3 酸碱度的影响取6个100 mL的圆底烧瓶，分别参加2.0 g藕节粉，再分别准确参加12.00 mL 0.15 m
