《各种转染试剂的中文转染方法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《各种转染试剂的中文转染方法（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、各种转染试剂的中文转染方法FuGENE6 （Roche）转染步骤：转染前一天将细胞分至培养板，转染当天细胞应50-80%融合。将细胞以1-3X 105/2 ml接种于6孔板后孵育过夜将达到如此密度。将FuGENE6 Reage nt在室温孵育10-15分钟。使用之前将FuGENE6颠倒混匀一下。1. 在PCR管中加入不含血清和双抗的营养液以稀释FuGENE6,直至总体积到100 ul。2. 将3-6 ul FuGENE6 Reage nt直接加入营养液，轻弹管壁混合。3. 加入1-2 ug 的 DNA溶液（0.02 2.0 ug/ul），轻弹管壁混合。4. 室温孵育20分钟。5. 将6孔板中的
2、旧营养液吸出，加入约1 ml不含血清和双抗的营养液洗涤一次, 再加入2 ml不含血清和双抗的营养液。6. 将转染复合物加入细胞，混匀使之均匀分布。7. 3-8小时后，加入血清或换成含血清的营养液。Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染试剂转染步骤（6 孑L板）：1. 转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90-95%。 细胞铺板在2 ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。2. 对于每孔细胞，使用250 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释4.0 ugDNA，轻轻混匀。3. 使用前将Lipofectamine 2000转染试剂
3、轻轻混匀，用250 ul无血清培养基 （如OPTI-MEM I培养基）稀释10ul Lipofectam in e 2000转染试剂，轻轻混匀。Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（30分钟）。 NOTE:若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。4. 混合稀释的DNA （第二步）和稀释的Lipofectami ne 2000 （第三步）。室温 放置20分钟。5. （optio nal）将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。加入 2 ml无血清配养基。6. 直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。7. 在37C，5%CO中保
4、温24-48小时。无需去掉复合物或更换培养基。或者在4-5小时后更换培养生长基也不会降低转染活性。8. 在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色， 检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染 一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要 数天或数周。贴壁细胞的稳定转染：转染后24小时，将细胞以$1:10的比例传代至新鲜培养基中，次日加入选择性Lipofectamine 2000转染试剂转染步骤（24孔板）：1. 转染前一天，胰酶消化细胞并计数（0.5-2X105），细胞铺板，使其在转染 日密度为90-95%。细胞
5、铺板在0.5 ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养 基中。2. 对于每孔细胞，使用50 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释0.8-1.0 ugDNA，轻轻混匀。3. 使用前将Lipofectami ne 2000转染试剂轻轻混匀，用50ul无血清培养基（如 OPTI-MEM I培养基）稀释1-3 ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。 Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（30分钟）。 NOTE:若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。4. 混合稀释的DNA （第二步）和稀释的Lipofectami
6、 ne 2000 （第三步）。室温 放置20分钟。5. （optional）将24孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。加入 0.5ml无血清配养基。6. 直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。7. 在37C，5%CO中保温24-48小时。无需去掉复合物或更换培养基。 或者在4-5小时后更换培养生长基也不会降低转染活性。8. 在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染 一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要 数天或数周。贴壁细胞的稳定转染：转染后2
7、4小时，将细胞以$1:10的比例传代至新鲜培养基中，次日加入选择性Effectene Transfection Reagent（Qiagen） 转染步骤：以下步骤适用于在6孔培养板中转染贴壁细胞。开始时，每6孔培养板使用0.4 ugDNA。尽管DNA的量看起来很少，但已足够用于转染。如果想获得最高的转染 效率，对每种细胞系的转染条件都要进行优化。1. 转染前一天，用5m l含血清和抗生素的培养基分装使每6孔培养板含2-8X 105的细胞（根据细胞类型而定）。2. 在细胞的正常培养条件下培养（通常37C和5%CO ）。转染当天细胞应40-80%2融合。3. 转染时，用DNA浓缩缓冲液（EC Bu
8、ffer）稀释1 ug DNA至100 ul总体积（DNA 用 pH 7-8 的 TE Buffer 溶解，DNA 最低浓度：0.1ug/ul）。加入 3.2 ul Enhancer， 涡旋1s以混合溶液。重要：请保持DNA与Enhancer比例恒定。注意：质粒DNA的质量会显著影响几个转染参数如转染效率、细胞增殖和细胞毒 性、以及对于结果的解释。因此，只应该使用最高纯度的DNA。使用HiSpeed, QIAfilter和QIAGEN Plasmid Kits抽提纯化的质粒适合于大多数细胞系的转染。 要获得最好的重复性和最好的结果，我们推荐使用Endofree Plasmid Kit，该 试剂
9、盒可以快速有效地在质粒纯化过程中去除细菌内毒素，从而获得最佳的转染 结果。4. 室温（15-25C）孵育2-5分钟，离心（spin down）几秒钟以从管顶去除液 滴。5. 向 DNA-E nhance 混合液中加入 10ul Effecte ne Tra nsfection Reage nt，反 复吸取5次或涡旋1 0秒钟以混合。注意：没必要一直把Effecte ne Reage nt置于冰上。在室温中放置10-15分钟不 会改变它的稳定性。6. 室温下（15-25C）孵育5-10分钟以形成转染复合物。7孵育过程中，从培养板上轻柔地吸出培养液，用4 ml PBS洗涤一次细胞。加 入1.6 m
10、l新鲜培养液（可以包含血清和抗生素）到细胞中。8. 加入0.6 ml培养液（可以包含血清和抗生素）至包含转染转染复合物的EP 管中。吸取两次以混合，立即将转染复合物drop-wise加入6孔培养板的细胞中。 轻摇培养板使转染复合物分布均匀。9. 将细胞与转染复合物在它们的正常培养条件下孵育适当的时间直至转染基因 表达。孵育时间和由所采用的实验和所使用的基因决定。Optional: 大多数情况下，不需去除转染复合物。然而，如果观察到细胞毒性， 则需在转染后6-18小时移除Effectene-DNA混合物，用PBS洗涤一次细胞，然 后加入5 ml新鲜细胞培养液。10. 瞬时转染时，进一步试验分析转
11、染基因的表达。转染P -gal或cat报告基因的重组子常在转染后孵育24-48小时以使转染基 因的表达最大化。稳定转染时，在转染后24-48小时，将细胞以1:51:10传代至合适的选择性培 养基中。保持细胞在选择性培养基中直至克隆出现。注意：我们推荐对每一细胞系和使用的抗生素建立一个致死曲线（剂量-反应曲 线）。但是一定要记住致死曲线受细胞密度的影响。以下步骤有时是必须的：将转染的细胞置于它们正常的培养液（如：不含选择性 抗生素的培养液），然后孵育1-2天，然后再加入选择性培养液。Superfect Transfection Reagent（Qiagen） 转染步骤：以下步骤适用于在6孔培养板
12、中转染贴壁细胞。如果想获得最高的转染效率，对 每种细胞系的转染条件都要进行优化。1. 转染前一天，用含血清和抗生素的培养基分装使每6孔培养板含2-8 X 105 的细胞（根据细胞类型而定）。2. 在细胞的正常培养条件下培养（通常37C和5%C02）。转染当天细胞应40-80% 融合。3. 转染时，用无血清培养基稀释2 ug DNA至100 ul总体积（DNA用pH 7-8的 TE Buffer溶解，DNA最低浓度：0.1ug/ul）。混合，离心几秒钟以从管顶去除 液滴。注意：质粒DNA的质量会显著影响几个转染参数如转染效率、细胞增殖和细胞毒 性、以及对于结果的解释。因此，只应该使用最高纯度的D
13、NA。使用HiSpeed, QIAfilter和QIAGEN Plasmid Kits抽提纯化的质粒适合于大多数细胞系的转染。 要获得最好的重复性和最好的结果，我们推荐使用Endofree Plasmid Kit，该 试剂盒可以快速有效地在质粒纯化过程中去除细菌内毒素，从而获得最佳的转染 结果。4. 向 DNA 稀释液中加入 10 ul Superfect Tra nsfectio n Reage nt，反复吸取 5 次或涡旋10秒钟以混合。注意：没必要一直把Superfect Reage nt置于冰上。在室温中放置10-15分钟不 会改变它的稳定性。5. 室温下（15-25C）孵育5-10分
14、钟以形成转染复合物。6孵育过程中，从培养板上轻柔地吸出培养液，用2ml PBS洗涤一次细胞。7. 加入600 ul培养液（包含血清和抗生素）至包含转染转染复合物的EP管中。 吹打两次以混合，立即将转染复合物加入6孔培养板的细胞中。轻摇培养板使转 染复合物分布均匀。8. 将细胞与转染复合物在它们的正常培养条件下孵育2-3小时。9小心移除Superfect-DNA混合物，用2 mlPBS洗涤3-4次细胞10. 加入新鲜的正常培养基，孵育24-48小时。11. 瞬时转染时，进一步试验分析转染基因的表达。转染P -gal或cat报告基因的重组子常在转染后孵育24-48小时以使转染基 因的表达最大化。稳定转染时，在转染后24-48小时，将细胞以1:101:15传代至合适的选择性培 养基中。保持细胞在选择性培养基中直至克隆出现。注意：我们推荐对每一细胞系和使用的抗生素建立一个致死曲线（剂量-反应曲 线）。但是一定要记住致死曲线受细胞密度的影响。以下步骤有时是必须的：将转染的细胞置于它们正常的培养液（如：不含选择性 抗生素的培养液），然后孵育1-2天，然后再加入选择性培养液
