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1、实验八 果蔬中维生素C的提取和定量测定（2,6-二氯酚靛酚滴定法）【原理】1.学习并掌握定量测定维生素C的原理和方法。2.了解蔬菜、水果中维生素C含量情况。维生素C是人类营养中最重要的维生素之一，缺少它时会产生坏血病，因此又称为抗坏血酸（ascorbic acid）。它对物质代谢的调节具有重要的作用。近年来，发现它还有增强机体对肿瘤的抵抗力，并具有化学致癌物的阻断作用。维生素C是不饱和多羟基物，属于水溶性维生素。它分布很广，许多水果、蔬菜中的含量更为丰富。维生素C具有很强的还原性。还原型抗坏血酸能还原染料2,6-二氯酚靛酚（DCIP），本身则氧化为脱氢型。在酸性溶液中，2,6-二氯酚靛酚呈红色
2、，还原后变为无色。因此，当用此染料滴定含有维生素C的酸性溶液时，维生素C尚未全部被氧化前，则滴下的染料立即被还原成无色。一旦溶液中的维生素C已全部被氧化时，则滴下的染料立即使溶液变成粉红色。所以，当溶液从无色变成微红色时即表示溶液中的维生素C刚刚全部被氧化，此时即为滴定终点。如无其它杂质干扰，样品提取液所还原的标准染料量与样品中所含还原型抗坏血酸量成正比。【试剂和器材】一、试剂2%草酸溶液: 草酸2g溶于100mL蒸馏水中。1%草酸溶液: 草酸1g溶于100mL蒸馏水中。标准抗坏血酸溶液（1mg/mL）: 准确称取100mg纯抗坏血酸（应为洁白色，如变为黄色则不能用）溶于1%草酸溶液中，并稀释
3、至100mL，贮于棕色瓶中，冷藏。最好临用前配制。0.1% 2,6-二氯酚靛酚溶液: 250mg 2,6-二氯酚靛酚溶于150mL含有52mg NaHCO3的热水中，冷却后加水稀释至250mL，贮于棕色瓶中冷藏（4）约可保存一周。每次临用时，以标准抗坏血酸溶液标定。二、材料：水果、蔬菜三、器材研钵，组织匀浆器，吸量管，抽滤设备，离心机，滤纸，容量瓶，滴定管，锥形瓶。【操作方法】一、提取水洗干净待测的新鲜蔬菜或水果，用纱布或吸水纸吸干表面水分。然后称取20g，加入1020mL 2%草酸，研磨成浆状，抽滤，合并滤液，滤液总体积定容至50mL。或者研磨后以2%草酸洗涤离心(4000r/min，10m
4、in)23次，合并上清液于50mL容量瓶中，定容至刻度。二、标准液滴定准确吸取标准抗坏血酸溶液1mL置100mL锥形瓶中，加9mL 1%草酸，以0.1% 2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至淡红色，并保持15秒不褪色，即达终点。由所用染料的体积计算出1mL染料相当于多少毫克抗坏血酸（取10mL 1%草酸作空白对照，按以上方法滴定）。三、样品滴定准确吸取滤液两份，每份10mL, 分别放入2个锥形瓶内，滴定方法同前。另取10mL 1%草酸作空白对照滴定。【计算】（VA-VB）CT100维生素C含量（mg/100g样品）= DW 式中：VA为滴定样品所耗用的染料的平均毫升数； VB为滴定空白对照所耗用的染料
5、的平均毫升数； C为样品提取液的总毫升数；D为滴定时所取的样品提取液毫升数；T为1mL染料能氧化抗坏血酸毫克数（由操作二计算出）；W为待测样品的重量（g）。【注意事项】(1) 某些水果、蔬菜（如橘子、西红柿等）浆状物泡沫太多，可加数滴丁醇或辛醇。(2) 整个操作过程要迅速，防止还原型抗坏血酸被氧化。滴定过程一般不超过2min。滴定所用的染料不应小于1mL或多于4mL，如果样品含维生素C太高或太低时，可酌情增减样液用量或改变提取液稀释倍数。(3) 本实验必须在酸性条件下进行。在此条件下，干扰物反应进行得很慢。(4) 2%草酸有抑制抗坏血酸氧化酶的作用，而1%草酸无此作用。(5) 干扰滴定因素有：
6、若提取液中色素很多时，滴定不易看出颜色变化，可用白陶土脱色，或加1mL氯仿，到达终点时，氯仿层呈现淡红色。Fe2可还原二氯酚靛酚。对含有大量Fe2的样品可用8%乙酸溶液代替草酸溶液提取，此时Fe2不会很快与染料起作用。样品中可能有其它杂质还原二氯酚靛酚，但反应速度均较抗坏血酸慢，因而滴定开始时，染料要迅速加入，而后尽可能一点一点地加入，并要不断地摇动三角瓶直至呈粉红色，于15秒内不消退为终点。【思考题】1为了测得准确的维生素C含量，实验过程中都应注意哪些操作步骤？为什么？2试简述维生素C的生理意义。【小资料】一、维生素C维生素C是人类膳食中必需的维生素之一，如果缺乏维生素C，将导致坏血病发生。
7、因此，维生素C又称为抗坏血酸，有防治坏血病的功效。抗坏血酸在自然界分布十分广泛，存在于新鲜水果和蔬菜中，尤其是柠檬果实和一些绿色植物（如青辣椒、菠菜等）中含量特别丰富。抗坏血酸在机体同具有广泛的生理功能，已知体内许多重要物质的代谢反应都需要抗坏血酸的参与。它是脯氨酸羟基化酶的辅酶，故有增进胶原蛋白合成的作用。机体中许多含疏基的酶，需要依赖于作为还原剂的抗坏血酸的保护，使酶分子的疏基处于还原状态，从而维持其催化活性。由于抗坏血酸的氧化还原作用，它可促进免疫球蛋白的合成，增强机体的抵抗力。同时还能使氧化型谷胱甘肽转化为还原型谷胱甘肽（简称GSH），而GSH可与重金属结合而排出体外，因此维生素C常用
8、于重金属的解毒。此外，抗坏血酸尚有许多其他生理功能，但其作用机理还不十分清楚。抗坏血酸是一种不饱和的多羟基内酯化合物，稍有酸味的糖类白色晶体，易溶于水，故属于水溶性维生素。在溶液中其分子内C2和C3之间的烯醇式羟基上的氢极易解离并释放出 H+ ，而被氧化成脱氢抗坏血酸，氧化后仍具有维生素C的生理活性，但它易分解为二酮古洛糖酸，此化合物不再具有维生素C的生理活性。维生素C有很强的还原性，在碱性溶液中加热并有氧化剂存在时，易被氧化而破坏。还原型和氧化型抗坏血酸可以互相转变，在生物组织中自成一氧化还原系统。由于维生素在营养学和临床方面的重要意义，故对食物和生物材料中维生素含量的测定是十分必须的。抗坏
9、血酸的定量测定方法很多，有2,6二氯酚靛酚（简称DCIP）滴定法、碘滴定法、2,4二硝基苯肼法、 Folin试剂比色法、紫外吸收法等。其中广泛采用的是DCIP 滴定法，它具有简便、快速、比较准确等优点，适用于许多不同类型样品的分析。缺点是不能直接测定样品中的脱氢抗坏血酸及结合抗坏血酸的含量，易受其他还原物质的干扰。如果样品中含有色素类物质，将给滴定终点的观察造成困难。在酸性环境中，抗坏血酸（还原型）能将染料2,6DCIP还原成无色的还原型2,6DCIP，而抗坏血酸则被氧化成脱氢抗坏血酸。氧化型2,6DCIP在中性或碱性溶液中呈蓝色，但在酸性溶液中则呈粉红色。因此，当用2,6DICP滴定含有抗坏
10、血酸的酸性溶液时，在抗坏血酸未被全部氧化前，滴下的2,6DCIP 立即被还原成无色，一旦溶液中的抗坏血酸全部被氧化时，则滴下微量过剩的2,6DCIP 便立即使溶液显示淡粉红色或微红色，此时即为滴定终点，表示溶液中的抗坏血酸刚刚全部被氧化。依据滴定时2,6DCIP 标准溶液的消耗量 (ml)，可以计算出被测样品中抗坏血酸的含量。氧化型2,6DCIP与还原型抗坏血酸常在稀草酸或偏磷酸溶液中进行反应。即先将样品溶于一定浓度的酸性溶液中或经抽提后，再用2,6DCIP标准溶液滴定至终点。食物和生物材料中常含有其他还原物质，其中有些还原物质可使2,6DCIP还原脱色。为了消除这些还原物质对定量测定的干扰，
11、可用抗坏血酸氧化酶处理，破坏样品中还原型抗坏血酸后，再用2,6DCIP 滴定样品中其他还原物质。然后从滴定未经酶处理样品时2,6DCIP标准溶液的总消耗量中，减去滴定非抗坏血酸还原物质2,6DCIP 标准溶液的消耗量，即为滴定抗坏血酸实际所消耗的2,6DCIP标准溶液的体积，由此可以计算出样品中抗坏血酸的含量。另外，还可利用抗坏血酸和其他还原物质与2,6DCIP反应速度的差别，并通过控制样品溶液在pH1 3 范围内，进行快速滴定，可以消除或减少其他还原物质的作用，一般在这样的条件下，干扰物质与2,6DCIP的反应是很慢的或受到抑制。生物体液（如血液、尿等）中的抗坏血酸的测定比较困难，因为这些样
12、品中抗坏血酸的含量很低，并且存在许多还原物质的干扰，同时还必须预先进行脱蛋白处理。在生物体液中含有巯其、亚硫酸盐及硫代硫酸盐等物质，它们都能与DCIP反应，但反应速度比抗坏血酸慢得多。样品中巯基物质对定量测定的干扰，通常可以藉加入对氯汞苯甲酸(简称PCMB)而得到消除。二、坏血病几百年前的欧洲，长期在海上航行的水手经常遭受坏血病的折磨，患者常常牙龈出血，甚至皮肤淤血和渗血，最后痛苦地死去，人们一直查不出病因。奇怪的是，只要船只靠岸，这种疾病很快就不治而愈了。水手们为什么会得坏血病呢？ 一位随船医生通过细心观察发现，水手在航海中很难吃到新鲜的水果和蔬菜。这位医生试着让水手天天吃一些新鲜的柑橘，奇
13、迹出现了坏血病很快就痊愈了。那么，柑橘为什么会有如此神奇的本领呢？经过长期的研究，科学家后来从新鲜的水果和蔬菜中提取出维生素C（又叫抗坏血酸），并证实坏血病就是维生素C缺乏症。疾病简介坏血病（scurvy），由维生素C缺乏引起，所以维生素C缺乏病主要是指坏血病。但维生素C缺乏不仅能引起坏血病，还与炎症、动脉硬化、肿瘤等多种疾患有关。坏血病在历史上曾是严重威胁人类健康的一种疾病。过去几百年间曾在海员、探险家及军队中广为流行，特别是在远航海员中尤为严重，故有“水手的恐怖”之称。关于坏血病的明确记载始于十三世纪十字军东征时代，有的学者追溯至公元前希波克拉底（Hippocrates）时代。另据称，在原
14、始社会人类的遗体上也曾发现坏血病的遗迹。关于坏血病的防治，早在17-18世纪就已经发现可以利用新鲜蔬菜、柑桔及柠檬等防治。1753年Lind的坏血病名著问卷心菜、肾上腺中提取出抗坏血病物质“已糖醛酸”（hexuronic acid）。与此同时，它的化学结构，1933年Reichstein人工合成成功，从而，人类终于征服了坏血病。但有关维生素C的理论和应用的研究则远未结束。病因和发病情况：主要由于食物中缺乏维生素C而致病，人工哺乳婴儿及成人食物中长期缺乏新鲜果蔬(嗜酒、偏食等)、或长期感染对维生素C需要量增多时，可患本病。症状：维生素C缺乏后数月，患者感倦怠、全身乏力，精神抑郁、虚弱、厌食、营养
15、不良，面色苍白，牙龈肿胀、出血，并可因牙龈及齿槽坏死而致牙齿松动、脱落，骨关节肌肉疼痛，皮肤淤点、淤斑，毛囊过度角化、周围出血，小儿可因骨膜下出血而致下肢假性瘫痪、肿胀、压痛明显、髋关节处展，膝关节半屈，足外旋，蛙样姿势。预防： (1)选择含维生素C丰富的食物，改进烹调方法，减少维生素C在烹调中丧失。人工喂养婴幼儿应添加含维生素C食物或维生素C。疾病，手术后，吸烟者、口服避孕药时、南北极地区工作者均应适当增加维生素C摄入量。(2)对症处理 如保持口腔清洁，预防或治疗继发感染，止痛，有严重贫血者可予输血，给铁剂。重症病例如有骨膜下巨大血肿，或有骨折，不需要手术治疗，用维生素C治疗后血肿可渐消失，骨折自能愈合。1
