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1、PEG8000沉淀法大量制备和纯化腺病毒质粒1取经小提质粒鉴定正确后的菌液于LB平皿上进行四区连续划线（划二区时，接种针无需烧灼处理），37培养过夜。挑取1个单菌落接种到500 ml 含特定抗生素的LB培养液内（可用1000ml三角烧瓶），于37，250300 rpm震摇过夜。2收集500 ml菌液至干净的离心管，离心，5000 rpm，20 min (肉眼观察上清液，应澄清、透明)。3弃上清，在洗水纸上扣干。先后加入溶液10 ml （用洗管将细菌充分悬起、混匀）, 溶液20 ml（上下颠倒混匀20次、室稳静置5 min）和溶液 15 ml（上下颠倒混匀20次）。离心，5000 rpm，15
2、min。4转移上清至干净的50 ml离心管（如果膜状物质比较松散，可以用parafilm进行简单过滤处理），加入0.6倍体积的异丙醇（27 ml），充分混匀。离心，4000 rpm，15 min。5弃上清，用3 ml TE (1mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH8.0)充分溶解所有沉淀（用吸管操作），加入等体积5 M LiCl（此时总体积为6 ml），混匀（此时溶液呈白色浑浊状），离心，4000 rpm，15 min。6转移上清（6 ml）至50 ml干净的离心管，加入0.6倍体积的异丙醇（3.6 ml），混匀。离心，4000 rpm，15 min。7弃上清，用0.5 ml
3、 TE 充分溶解沉淀（首先应确定沉淀的位置。分两步溶解，先加300 ml充分溶解并转移DNA后，再用200 ml溶解剩余沉淀并转移。溶解时，最好使用吸管），并将溶液转移至1.5 ml Ep管（此时溶液为无色、稍粘稠液体），加入5 ml RNaseA，37 1 hr。加入等体积的1.6 M NaCl 含13% PEG 8000，倒置混匀数次，可观察到白色絮状沉淀。4离心，13 krpm，10 min。8弃上清，加入0.5 ml TE 溶解Ep管底部的白色沉淀。将沉淀轻轻弹起，55，1 hr或更长时间。期间倒置数次以促进DNA溶解（Ep管盖受热后极易弹开，要小心操作，或者用胶带将Ep管盖固定）。D
4、NA充分溶解后，溶液为无色粘稠液体。9先后用酚和氯仿两步抽提DNA。酚、氯仿抽提是纯化DNA的重要步骤，关系到DNA的质量，应仔细操作。首先加入等体积酚（取酚时，应注意避开水相），剧烈倒置混匀数次，13 krpm，8 min，用200 ml移液器转移含DNA的上层水相到一新的Ep管中，避免吸到酚层液体。加入等量氯仿，剧烈倒置混允数次，13 krpm，8 min，移液器转移含DNA的上层水相到一新的Ep管中，避免吸到氯仿层液体。10直接加入100%乙醇，倒置混匀数次（可见到明显的絮状沉淀），10 krpm，5min离心（肉眼观察，在Ep管底部有白色或无色透明的DNA沉淀，有时沉淀也会出现在管壁上
5、。），小心弃取上清，37，干燥30 min。应充分干燥，最好在超净工作台内打开风机干燥，10用500 ml TE，充分溶解DNA（无色、透明物质）。55，30 min，并用移液器反复吹吸数次直至完全溶解（估计可获得至少40300 mg 质粒）。应注意无菌操作 备注：1溶液配制：（其作用是溶解细菌）溶液：配制10 贮存液，置4或-20保存；溶液：使用前配制。为使溶液的配制更加方便，NaOH和SDS贮存液的浓度可分别为4N和20%。使用时，均进行20稀释。（NaOH和SDS的终浓度分别为0.2N和1%，溶液作用是裂解细胞壁，）溶液 ：可大量配制，置室温保存，其中醋酸钾可与冰醋酸同时配制，醋酸钾的终
6、浓度为3 M。要使用玻璃器皿贮存。2方法中观察到的一些现象，如100%乙醇沉淀时，出现絮状沉淀现象，仅见于分子量较大的腺病毒质粒。分子量较小的质粒，出现乳糜状沉淀。3获得质粒后，应通过检测OD260值，获得质粒浓度。4该法可制备各种大小质粒（40 kb）。其纯度和CsCl梯度离心法近似。可满足各种转染的需求。溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。 溶液I的作用。适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液是用于控制好溶液的pH。加了葡萄糖后最
7、大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。 溶液II。这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳 的溶解细胞的试剂，用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便
8、是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂。 溶液III溶液III加入后的沉淀实际上是钾离
9、子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。2 M的醋酸又是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基
10、因组DNA混入。 不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，不然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解。这里用25/24/1的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的，这里做个全面的介绍。酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互
11、溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。 回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。这时候如果放到20，时间一长反而会导致大量盐的沉淀，这点不同于普通的DNA酒精沉淀回收，所以不要过分小心了。高浓度的盐会水合大量的水分
12、子，因此DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。如果感觉发生了盐的沉淀，就用70的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并用tip将沉淀打碎，就能得到好的样品。得到的质粒样品一般用含RNase（50 ug/ml）的TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的。琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带，但千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，不信的话你用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。 非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有710条带，这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。2
