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1、实验三 高效液相色谱法测定水样中的苯酚一、实验目的1.1 熟悉HPLC仪器的各个部件及熟悉操作方法；1.2 掌握应用高效液相色谱法对苯酚的定性、定量分析；1.3 掌握水样中苯酚的测定。二、实验原理HPLC原理高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。 特点 1高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，
2、必须对载液施加高压。一般可达150350105Pa。 2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达110ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于 1h 。 3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。 4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。 5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱
3、法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于 400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的 75% 80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。 据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占7080%。 高效液相色谱仪一般分为四个部分：高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。此外还可以根据一些特殊的要求配备一些附属装置，如梯度洗脱、自动进样及数据处理装置等，如图1所示。图1 液相色谱仪结构示意图及工作流程图 方法原理：在相同的色谱条件下，相同物质具有
4、相同的保留时间，据此可对某物质进行定性分析；在一定浓度范围内，待测物质含量与仪器响应值呈线性关系，通过建立标准曲线，可实现对待测物质的定量分析。三、仪器和试剂1、仪器：岛津（SHIMADZU）LC-20A液相色谱仪：流动相：乙腈、MQ水（由铝箔纸包裹，防止其中产生藻类，堵塞进口）高压输液泵：并联式微体积柱塞往复泵 （Prominence LIQUID CHROMATOGRAPH）型号：LC-20AD厂家：UFLC SHIMADZU色谱柱：固定相填充物：十八碳（C18）型号：Intertsil ODS-SP参数： 填充物粒径：5 m 内径长度：4.6250 mm检测器：二极管阵列检测器（PDA）
5、型号：SPD-M20A 电压：230V厂家：SHIMADZU脱气装置： 型号：DQO-20A5进样装置：高压六通进样阀两个状态： Load：样品进入六通阀，未入色谱柱 Inject：位于六通阀的样品进入色谱柱种类：SIL-10A 、SIL-10Ai 、SIL-10ADVP淋洗液（洗针、洗阀）：甲醇移液管 2 mL、5 mL各一支具塞离心管10 mL三支、1.5 mL一次性离心管一支2. 试剂：甲醇（色谱纯）； 苯酚标准使用溶液（10 mg/L） 待测水样。四、实验步骤1 标准系列配制 取苯酚标准使用液0.50、1.00、2.00 mL于10 mL的具塞离心管中，用甲醇定容至5 mL，混匀。待测
6、。2 样品的制备 取水样约1 mL于1.5 mL一次性离心管中。待测。3 色谱参数色谱柱：C18 柱；流动相：乙腈、水；梯度洗脱程序：洗脱时间0:004:004:015:005:018:00乙腈（%）656575756565流速：1.0 mL/min；柱温：室温；进样量：20 L；检测器：二极管阵列检测器，检测波长280 nm4 测定测定标准系列，再测定样品。根据标准系列中苯酚的保留时间，定性确定样品中的目标物。记录标准系列和样品中目标物的峰面积。五、数据记录与计算（1）标准系列c=4mg/mL的谱图及样品的谱图：样品谱图（图2）中，三个明显高的峰的记录数据如下表表1 样品的谱图中三个峰的特征
7、数据保留时间（t/min）色谱峰面积/counts色谱峰高/mAU第一个峰3.892229072928第二个峰4.307182.47第三个峰4.87920567图1 标准系列c=4mg/mL的谱图图2 样品的谱图2. 标准系列和样品中苯酚的保留时间、峰面积、峰高等实验数据：表2 标准系列和样品中苯酚的谱图峰的特征数据标准样品体积/mL保留时间t/min色谱峰面积/counts色谱峰高/mAU浓度/(mg/mL)10.53.9511764012091.021.03.8373475429632.032.03.7736662552584.0样品3.8922290729281.3六、思考题1 液相色谱
8、使用的注意事项；答：流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)，气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器，C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗，更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中，更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。2 何谓梯度洗脱，有何特点；答：梯度洗脱是采用两种(或多种)不同洗脱能能力的溶剂,在分离过程中按一定程序连续改变流动相的浓度配
9、比和极性的一种洗脱模式.当样品混合物中化合物的保留差异很大,用单一流动相等度洗脱时,分离时间太长,而且随保留值增大,后洗脱的色谱峰谱带变宽,使峰检测发生困难.有时甚至会发生部分化合物保留太强,不能洗脱下来,此时采用梯度洗脱.梯度洗脱一般用液相色脯装置来实现.高压梯度,低压梯度两种装置.3 正相高效液相色谱与反相有何差别。 答：高效液相色谱法包括正相高效液相色谱法和反相高效液相色谱法。正相高效液相色谱法中流动相的极性小于固定相的极性，也就是以及性键合相为固定相（常以氨基、氰基键合相等作为固定相）。反相高效液相色谱法中流动相的极性大于固定相的极性，也就是以非极性键合相为固定相（常以十八硅烷C18、辛烷C8、甲基C1、苯基等作为固定相）。
