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1、乙型病毒性肝炎的基因检测及其临床意义提要：目的：通过对乙肝基因检测的阐述及其与其他方法学的对比，凸显其在乙肝治疗的重 要性。方法：乙肝病毒基因定量检测及免疫胶体金法检测。结果：基因检测灵敏度高，可 判断病毒是否处于复制期，且其结果数值可直接反应病毒复制状况。结论：乙肝基因检测对 乙肝患者的治疗有极其关键的指导作用。关键字:HBVPCR HBV-DNAHBV感染人体后，可从血中测得抗原和 抗体类物质，称为血清标志物；同时，也可 测出病毒的基因组核酸或其它相关核酸，如 HBV-DNA和HBV-DNAp，称为分子标志物；这 些标志物的存在和变化，反映病毒在宿主中 的状态和病情的发展情况，是病毒性肝炎
2、的 重要实验室诊断依据。HBV是乙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌的 主要致病因素。全球约20亿人为HBV易感 人群，3.5亿为慢性HBV感染者，乙肝病毒 有8个基因型，其中中国有4个基因型。1关于乙肝病毒的介绍 1.1乙肝病毒的特点1.1.1 HBV的基因变异性HBV是极度变异的病毒之一，变异是病 毒的特性，往往给临床诊断带来一定的困 难。1.1.2 HBV的嗜肝性HBV的一旦进入人体只侵袭肝脏。1.1.3 HBV的感染的慢性化由于乙肝不能彻底的根治，长期下来多 转为慢性乙肝这个过程可达几十年，所以它 是一个重要的传染源。1.1.4 HBV的致癌性目前可以肯定HBV是诱发肝癌的重要病 因，有80-9
3、0%的肝癌患者有乙肝病史。1.1.5 HBV具有顽强的抵抗力能耐受低温、紫外线、干燥和一般消毒 剂。100C 10分钟高压蒸汽灭菌，0.5的过 氧乙酸等能使HBV灭活。1.1.6 HBV具有严格的种属特点HBV仅在人或黑猩猩身上生存。1.2乙肝病毒的基因组成HBV基因组为双链不完全环状DNA,由 3200个核苷酸组成，其负链包括四个开放读 框架区：1、S基因区，由S基因、前S2基因(Pre-S2)和前S1基因(Pre-S1)组成，分 别编码HBsAg、前S2和前S1蛋白或抗原 (Pre-S2Ag 和 Pre-S1Ag)。2、C 基因区，由前C基因和C基因组成，分别编码HBeAg 和HBeAg。
4、3、P基因区，编码乙型肝炎病毒相关DNA聚合酶(DNAp),其具有逆转录 酶活性。4、X基因区，编码乙肝病毒X抗 原，具有激活HBeAg基因的功能。2. 乙肝病毒检测及定量检测的临床意义HBV-DNA是乙肝病毒的核心成分，是病 毒复制及有传染性的标志，是病毒感染的最 直接、特异和灵敏指标。急性乙肝时， HBV-DNA阳性超过8周可变慢性。在慢性 感染时HBV-DNA可结合到肝细胞DNA中， 称为整合型HBV-DNA，如HBV病毒基因已 整合至宿主基因，治疗药物则难以到达，这 是HBV不易从体内清除的重要原因之一。 PCR法检测HBV-DNA，既可以定性，又可以 定量，其临床应用有：2.1病情评
5、估肝炎病毒在肝细胞内大量复制是导致 肝细胞免疫损伤的启动因素。血清HBV-DNA 含量高低与肝脏病理损害程度相关， HBV-DNA水平越高，肝组织炎症反应越重。 据此,通过定量检测HBV-DNA含量可以间接 评估慢性肝炎患者肝脏损伤的情况。2.2疗效观察用抗病毒药物治疗慢性病毒性肝炎，治 疗前病毒基因水平愈高，疗效越差；水平愈 低，清除病毒可能性越大。相应地，在治疗 过程中，病毒基因水平下降愈快，完全治愈 的机会越大。因此可将肝炎病毒基因检测作 为预测和观察抗病毒疗效的一种手段。 2.3预后判断治疗或未经治疗的慢性病毒性肝炎， 病毒基因水平保持稳定高浓度者预后不良；垂直传播途径感染肝炎病毒者，
6、病毒基因 含量高，对各种抗病毒治疗的反应低，预后 差；病程中，尽管反映肝细胞损害的其它 指标正常，但病毒基因水平经常波动者易发 展为肝硬化。2.4药效验证：任何一种抗病毒药物对肝 脏的损害都是很大的。治疗后定量PCR可直 接准确地测定体内病毒数量，有助于疗效的 判断，指导临床合理用药。所以说HBV-DNA定量检测指标在乙肝治 疗中有着非常重要的意义，一般以定量检测 1.0E3以下为阴性，以上为阳性。阳性提示 体内病毒复制活跃，血液中含量高，传染性 较强；阴性则相反，病毒复制已得到抑制， 血液中含量底，传染性弱。只有体内的 HBV-DNA定量指标降低，病毒的复制繁殖才 会停止，乙肝的彻底治愈才有
7、希望。3. HBV的定量检测方法及其原理3.1 PCR的介绍自Mullis 1983年发明聚合酶链反应（PCR ）这种核酸扩增技术以来，它已深入 到生命科学研究的每一个角落，且派生出了 各种各样的有其独特使用目的的核算扩增 检测技术。至120世纪90年代中期，国内的临 床实验室将PCR技术广泛地用于HBV的临床 检测。3.2 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性 依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性一退火一延伸三个基本反应步骤 构成。3.2.1模板DNA的变性模板DNA经加热至93C左右一定时间 后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双 链DNA解离，成为
8、单链，以便它与引物结合, 为下轮反应作准备。3.2.2模板DNA与引物的退火（复性）模板DNA经加热变性成单链后，温度降 至55C左右，引物与模板DNA单链的互补序 列配对结合。3.2.3引物的延伸DNA模板一引物结合物在DNA聚合酶的 作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模 板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合 成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制 链，重复循环变性一退火一延伸三过程就可 获得更多的“半保留复制链”，而且这种新 链又可成为下次循环的模板。每完成一个循 环需24分钟，23小时就能将待扩目的基 因扩增放大几百万倍。4. PCR及免疫学检测血清HBV的结果目前检查乙肝病人最
9、常用的方法是化 验“两对半”，即乙肝病毒抗原和抗体的测 定（现用胶体金法只做HbsAg和HBeAg）。 但它检查的只是乙肝病毒的抗原和人体对 这些抗原的免疫反应，并不能代表病毒本身 的复制情况。乙肝患者的治疗过程，为了检 查乙肝病毒再人体内的复制状况，需要先进 的病毒检测技术，PCR技术就是目前最为先 进的病毒检测技术。下表是收集医院88个 送检PCR血液标本，分别做PCR定量检测和 免疫学方法对比，列出43例。样本编 号PCR结果免疫结果HBsAgHBeAg12.55E6+21.14E3+31.23E7+41.0E3+51.0E3+65.00E7+71.0E381.0E395.11E6+10
10、1.56E6+112.29E6+124.69E6+131.0E3+147.93E3+151.15E3+164.37E7+171.0E3+181.0E3+193.75E7+204.07E7+211.0E3+221.0E3+231.0E3241.54E4+251.0E3+261.0E3+271.0E3+281.0E3291.48E4+301.37E6+311.0E3321.0E3+333.45E7+341.0E3+351.0E3+361.0E3+374.54E3+381.48E7+392.24E7+401.0E3412.33E7+422.47E4+431.0E3+由上表的43个样本检测结果可看出：
11、 4、 5、 13、 17、 18、 21、 22、 25、 26、 27、 32、34、35、36、43号样本PCR检测值小于 1.0E3 但 HbsAg 阳性 2、9、11、14、15、 24、29、30、37、42号样本PCR检测值大于 1.0E3, HbsAg 阳性1、3、6、10、12、 16、19、20、33、38、39、41 号样本 PCR 检测值大于1.0E3, HbsAg阳性，HbeAg阳性 7、8、23、28、31、40号样本PCR检测值 小于1.0E3，HbsAg阴性。在总的88个样本中，PCR检测值小于 1.0E3但HbsAg阳性有41个；PCR检测值大 于1.0E3，
12、HbsAg阳性有21个；PCR检测值 大于1.0E3，HbsAg阳性，HbeAg阳性有19 个；PCR检测值小于1.0E3, HbsAg阴性有7 个。对于实验结果的解释:PCR检测值小于 1.0E3但HbsAg阳性则表明血液中存在 HBV-HbsAg但此病毒不处于复制期，传染性 较小；PCR检测值大于1.0E3，HbsAg阳 性或HbeAg阳性则表明血液中存在HBV病毒 并处于复制期，有较强的传染性，其中PCR 值越高则传染性越强；PCR检测值小于 1.0E3, HbsAg阴性则表明血液中不存在HBV 病毒。5. 实验结论由实验结果及其分析可看出PCR法检测 的优点：PCR法特异性好，灵敏度高
13、，可用 于早期诊断，还可作为临床疗效的评估oPCR 法检测可作为判断HCV感染有无传染性的可 靠指标，阳性则表示病毒存在，有传染性。 对于预防乙肝大三阳和乙肝小三阳的传染 有很大的作用.通过PCR检查，可以知道病毒在体内存 在的数量，是否复制，是否具有传染，有无 必要进行药物治疗，适用哪一类抗病毒药 物，以及对药物是否耐药等，从而制定适合 病人的治疗方案。6对治疗乙肝的展望目前来说，第一，抗病毒治疗的病人发 生肝硬化和肝癌几率比不进行抗病毒治疗 的病人要低得多。所以新抗病毒药物的出 现，使我们有更多治疗乙肝的手段，疗效会 越来越好，这使慢性乙肝患者发展成肝硬 化、肝癌的危险性越来越低。第二，随
14、着治疗理念的更新，医生的经 验会越来越丰富，治疗效果会更好。现在又 提出了个体化的治疗，即根据病人的特点制 定优化的治疗方案，并在治疗过程中定期监 测、及时改变治疗方案。第三，优化治疗方案。通过十一五重大 专项的研究，我国将来会研究出新的优化的 治疗策略和治疗方案。慢性乙肝的治疗会越 来越科学，越来越进步，疗效也将越来越好。参考文献1 申子瑜，李金明临床基因扩增检验 技术M.北京：人民卫生出版社，2002， 34-372 何宗忠，裘宇容.乙型肝炎病毒生物 标志物检测的研究进展.分子诊断与治疗杂志J.2009.1 (2)： 135-1403 陈国生，梁晓峰，胡俊峰.乙型肝炎 病毒感染血清学标志与慢性感染自然史研 究进展中国疫苗和免疫J.2009.15(3)： 279-2834 刘娜，徐光华，张雅芳，等对乙型 肝炎病毒血清标志物测定意义的新认识现 代诊断与治疗J.2009.20 (5)： 287-290
