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1、大鼠增龄过程中骨质疏松与椎间盘退变的相关性分析【摘要】 目的 研究大鼠增龄过程中骨质疏松症和椎间盘退变的相关性。方法 50只健康纯种SD大鼠，喂养22个月，建立老龄大鼠模型，进行股骨、胫骨、腰椎等组织学观察，并评价椎间盘退变的相关指标(椎间盘软骨型和型胶原表达、软骨终板血管芽相对面积、软骨终板钙化层/非钙化层厚度)与骨质疏松的相关指标(骨皮质厚度指数、骨小梁相对面积、骨密度、骨最大应力和应变)的相关性。结果 骨质疏松相关指标骨皮质厚度指数、骨小梁相对面积、股骨密度、椎体骨密度与椎间盘退变指标终板血管芽相对面积、非钙化/钙化层比值、型胶原定量之间存在中度到强度的负相关，而与型胶原表达存在中度到强
2、度的正相关，其中椎体骨密度与软骨终板的型胶原相关性最强。骨生物力学指标最大变形和最大负荷与椎间盘退变的各个指标无相关性。结论 骨质疏松和椎间盘退变呈负相关，这种相关并不能完全归因于环境因素；而骨生物力学最大变形、最大负荷和椎间盘退变无相关性。【关键词】 骨质疏松症；椎间盘；老龄大鼠Analysis of the correlation between osteoporosis and degeneration of intervertebral disc in the aging ratABSTRACT: Objective To study the correlation between o
3、steoporosis and degeneration of intervertebral disc in the aging rat. Methods Fifty healthy SD rats were fed for twentytwo months in order to build the model of aging rats, the histology of femoral bone, tibial bone and lumbal vertebra was used to observe, then we evaluated the indexes which reflect
4、 the degeneration of intervertebral disc including the quantity of collagen type , of intervertebral disc by the immunohistochemistry methods, the relative area of vascular bud, the thickness of calcified layer and uncalcified layer on cartilage endplate and the indexes which reflect the osteoporosi
5、s including the thickness ratio of cortical bone, the relative area of bone trabecula, the bone density, the max stress and straining of bone. Results There was moderate or strong negative correlation among the indexes of the degeneration of intervertebral disc including the relative area of vascula
6、r bud, the ratio of the uncalcified and the calcified layer, the quantitation of collagen type and the indexes of osteoporosis including the thickness ratio of cortical bone, the relative area of bone trabecula, the density of femoral bone and vertebral body bone, the max stress and straining of bon
7、e. However, there was moderate or strong positive correlation with the quantitation of collagen type , of which the bone density of vertebral body had the strongest dependablity with collagen type . And the indexes of bone biomechanics including the max stress and straining had no correlation with t
8、he indexes of degeneration of intervertebral disc. Conclusion Osteoporosis has negative correlation with the degeneration of intervertebral disc, which is not distributed to the environment factors; but the indexes of bone biomechanics including the max stress and straining have no correlation with
9、the indexes of degeneration of intervertebral disc.KEY WORDS: osteoporosis; intervertebral disc; aging rat骨质疏松和椎间盘退变都是和增龄有密切相关的病理过程，有学者提出两种病理过程可能存在一定的相关性，有相似的发病机制1。但最近，流行病学调查显示，骨质疏松症和椎间盘退变症的患病呈负相关，部分学者把这种结果归于环境因素，认为直立行走及活动所致的过多应力增加了骨矿密度，同时增加了椎间盘的“劳损”，加速了椎间盘的退变。然而，目前缺乏试剂与仪器 、型胶原鼠单克隆抗体由德国ErlangenNumbe
10、rg大学分子生物学实验中心提供；碱性磷酸酶生物素标记的抗鼠IgG由华美生物有限公司提供；透明质酸酶、链酶蛋白酶、蛋白水解酶、3hydroxy2naphthylocid2, 4dimethylaniline、Fast red均来自美国Sigma公司。高清晰病理图像分析仪为北航医学生物公司产品；组织切片机为德国Ainca公司产品；QDR2000型HOLOJAC双光子骨密度仪和电子万能生物力学试验机为美国PE公司产品。实验动物和方法大鼠老龄性模型的建立 取同批健康纯种SD大鼠50只(由西安交通大学动物实验中心提供)，雌性，全部饲养条件一致，自由摄食，喂以大鼠标准饲料，饮用蒸馏水，达22月，体重为22
11、0-310g，未曾生育，处死作为老龄大鼠组(年龄22月)。取材 实验动物在20g/L乌拉坦溶液麻醉下，腹腔动脉抽血处死，取动物双侧后肢股骨、胫骨，腰椎等组织，分别固定于40g/L多聚甲醛溶液中或放置于低温冰箱保存待用。其中L1、L2椎体和左股骨用于进行骨密度检测，左侧股骨检测完骨密度后再行生物力学实验，右下肢和L3、L4用于作组织学检查。形态学检查 分取L3-4脊柱节段，包括L3、L4椎体及L3-4椎间盘，股骨中1/2处，胫骨中上段(包含膝关节)，经40g/L多聚甲醛溶液固定，80g/L的中性EDTA脱钙液脱钙40d，常规石蜡包埋，用90g/L的多聚赖氨酸处理载玻片，切片，每张6-8m，HE染
12、色。免疫组化方法测定、型胶原表达 椎间盘组织切片用二甲苯脱蜡、逐级乙醇水化后，用透明质酸酶(Hyaluronidase 2g/L)室温孵育30min。型胶原用链霉蛋白酶(Pronase 1g/L)，型胶原用蛋白酶(Protease /L)室温处理30min，加入一抗在4孵育过夜，用碱性磷酸酶生物素标记的第二抗体孵育30min。用3hydroxy2naphtylocid 2, 4dimethylanilid在室温下进行呈色反应。细胞核用苏木素复染，用水溶性封片剂封固观察。阳性表达为基质和细胞周围出现红染颗粒，应用图像分析系统进行灰度扫描并分析，灰度扫描切片细胞核不复染。软骨终板血管芽相对面积测量
13、 取HE染色切片，低倍光学显微镜下(40)计数软骨终板血管芽数(头侧和尾侧血管数之和除2)。血管面积占终板区域相对数使用方格法(图1)。各组取10个标本，各个标本连续8m横断面切片2张，显微镜下采集图像，尺寸定标，形成图形数据，医学图像分析软件自动分析。软骨终板钙化层、非钙化层厚度测量 采用HE染色切片，以潮标为分界线，40倍显微镜下，测定每组椎间盘软骨终板正中矢状面的前侧1/3、中心点、后侧1/3钙化层和非钙化层的厚度，取3处测量的平均值，计算非钙化层/钙化层比值(图2)。图1 血管面积相对数计算示意图The relative area of blood vessel (HE100)图2 软
14、骨终板钙化层、非钙化层厚度测量The measurement of cartilage endplate (HE100)骨皮质厚度指数测量 取股骨中部横断面HE染色切片，光学显微镜下测量计算骨皮质厚度指数，计算方法 骨皮质厚度指数AB+CD/AD 其中AB、CD、AD如图3所示(4-8个部位处测量后求均值)。骨小梁相对面积测量 胫骨中上的石蜡切片经HE染色后应用图像分析系统分析测量。以关节软骨1mm以下的松质骨区域，每张切片测量3个视野(40，测定面积限定为274753m2)，取平均值，测量平均骨小梁相对面积。图3 骨皮质厚度指数测量示意图The index of bone cortical
15、thickness骨矿密度测定 用QDR2000型HOLOJAC双光子骨密度仪测量四肢骨与腰部椎体骨矿密度，放射源为镅241Am，误差3%。测量时，将各离体骨按一定顺序放入有机玻璃盒内，每次放入7个标本。使用Regional high resolution QDR 4500小动物分析软件。生物力学测定 右股骨用微机控制电子万能试验机进行三点力学试验，观察最大应力和应变。当外力作用于骨时，骨以形变产生内部的阻抗来抗衡外力，即骨产生的应力，用最大负荷力表示，单位为g/cm2。应变是指骨在外力作用下的变形，用应力作用后至断裂的最大位移距离表示，单位为厘米。测量时，调整两个约束支架相距20mm，将大鼠
16、股骨比较均匀的部位放在约束支架上，股骨的短轴与垂直方向平行，逐级加压直至破坏，读取导致破坏的负荷的数据。待测标本用生理盐水保持湿润，荷载测量精度为(牛顿)，变形测量精度为。统计学处理 所有数据输入计算机，用SPSSfor windows软件进行变量Pearsons相关分析，计算结果以均值标准差(s)表示，以为差异有统计学意义。2 结果组织学观察 老龄大鼠出现了骨质疏松的征象，如骨小梁稀疏，排列不整，骨小梁间隙增大，骨小梁面积比增大等；同时出现了椎间盘退变的征象，如软骨终板血管芽减少，纤维环排列不规则等。各个相关指标检测结果见表1。骨质疏松和椎间盘退变的相关性分析 骨皮质厚度指数、骨小梁相对面积、股骨骨密度、椎体骨密度与终板血管芽相对面积、非钙化/
