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1、。一细菌培养基：肉膏蛋白胨培养基是一种广泛用于培养细菌的培养基 ,肉膏蛋白胨培养基的主要成分是牛肉膏、蛋白胨和NaCl。肉膏蛋白胨培养基1. 药品比例 ：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，Nacl5g，琼脂 1520g，水 1000mL，PH7.47.62. 实验器材：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/L NaOH、 lmol/LHCl、KNO3、NaCl、K2 HPO43H2O、MgSO47H2O、FeSO47H2O、4.5mL 无菌水 6 管，10%酚液，49.5mL 无菌水 ( 带玻璃珠 )1瓶。土壤样品、试管、培养皿、移液管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、
2、天平、称量纸、牛角匙、 pH试纸、棉花、报纸、记号笔、线绳、纱布、酒清灯。电炉、高压蒸气灭菌锅、超净工作台 .3. 配置方法（ 1）称药品：按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯中称量，用热水溶解后倒入大烧杯。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。（ 2）加热溶解：在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入己溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。（ 3）调 pH：检测培养基的 pH，若 pH偏酸，可滴加 lmol/L N
3、aOH，边加边搅拌，并随时用 pH试纸检测，直至达到所需 pH范围。若偏碱，则用 lmol/L HCl 进行调节。 pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。（ 4）过滤：液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4 层纱布趁热过滤，以利培养的观察。但是供一般使用的培养基，这步可省略。（ 5）分装：按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。分装量：固体培养基约为试管高度的 l/5 ，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。 半固体培养基以试管高度的 1/3 为宜，灭菌后垂直
4、待凝。（ 6）加棉塞：试管口和三角瓶口塞上用普通棉花 ( 非脱脂棉 ) 制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约3/5 塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用 8 层纱布制成通气塞。 有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。（ 7）包扎：加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应以5支或 7 支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好。然后用记号笔注明、培养基名称、组别、日期。（ 8）灭菌：将上述培养基于 121.3 湿热灭菌 20mi
5、n。如因特殊情况不能及时灭菌，则应故人冰箱内暂存。（ 9）摆斜面：灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，便斜面的长度不超过试管总长的1/2 。（ 10）无菌检查：将灭菌的培养基放入 37温箱中培养 2448h，无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。二 . 放线菌培养基 : 高氏合成一号培养基是一种用于培养放线菌的合成培养基 , 培养基中的可溶性淀粉作为碳源和能源， KNO3作为氮源， K2HP04、MgSO4和 FeS04 作为无机盐等高氏合成一号培养基1. 药品比例：可溶性淀粉20gNaCI0 5gKNO31gK HPO 3H O0 5g242MgSO
6、47H2O05gFeSO 7 HO001g42琼脂1525g水1000mlpH7.4 7.62. 实验器材：试管，锥形瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，培养基分装器，天平，高压蒸汽灭菌器， PH试纸，棉花，牛皮纸，麻绳，纱布3. 配制方法：（1）、称量和溶化按配方先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少于所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。然后再称取其他各成分，并依次溶化，对微量成分 FeSO4 7 H2 O 可先配成高浓度的贮备液，按比例换算后再加入。 待所有试剂完全溶解后，补充水分到所需的总体积。配制固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的试剂中，在加热融化，最
7、后补充所损失的水分。（2）、调 pH用试纸测培养基的原始PH,如果偏酸，用滴管向培养基中加入1mol/LNaOH,边滴边搅拌，并随时用pH试纸测其 pH,直至 pH达 7.6 。反之，用 1mol/LHCI 进行调节。（3）、分装和加塞将配制的培养基分装入试管内，在试管口或锥形瓶口上塞上棉塞。（4）、包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，其外再用一根麻绳扎好。 用记号笔注明培养基名称、 组别、配制日期。（5）、灭菌将上述培养基以1210C,20min,0.103MPa 高压蒸汽灭菌。（6）、搁置斜面将灭菌的试管培养基冷却至 500C左右，将试管口端搁在玻璃棒上。斜面的斜度要
8、适当，使斜面的长度约为管长 1/3 。（7）、无菌检查将灭菌培养基放入 370C 的培养箱中培养 2428h，以检查灭菌是否彻底。三真菌培养基：马铃薯糖琼脂培养基（马丁氏培养基）马铃薯糖琼脂培养基1. 药品比例K2HPO41g，MgSO47H2O 0.5g ，蛋白胨 5g，葡萄糖 l0g ，琼脂 1520g，水 1000mL，自然 pH此培养液 1000ml 加 1%孟加拉红水溶液 33ml 。临用时每 100ml 培养基中加 1%链霉素液 0 3ml。（孟加拉红和链霉素主要是细菌和放线菌的抑制剂，对真菌无抑制作用，因而真菌在这种培养基上可以得到优势生长，从而达到分离真菌的目的）2. 实验器材
9、KH2PO4，MgSO4?7H2O，蛋白胨，葡萄糖，琼脂，孟加拉红，链霉素；试管，三角烧瓶，量筒，玻棒，培养基分装器，扭力天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅3. 配制方法（ 1）称量和溶解：先计算后称量，按用量称取各成分，并将其溶解在少于所需的水中。 待各成分完全溶解后， 补充水分到所需体积。再将孟加拉红配成 1%的水溶液，在 1000mL培养液中加入以上孟加拉红溶液 3.3mL，混匀后，加入琼脂加热融化，方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制。（ 2）分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白膝培养基配制。（ 3）链霉素的加入：链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化后待温度降至 45左右时才能加入。可先将
10、链霉素配成 1%的溶液 ( 配好的链霉素溶液保存于 -20 ) ，在 100mL培养基中加 1%链霉素 0.3mL ，使每毫升培养基中合链霉素 30g。四灭菌采用高压蒸气灭菌法进行灭菌，步骤如下：1首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。切勿忘记加水，同时水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。2放回内层锅，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与锅壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。3加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。4
11、用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加到逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.1Mpa，121.5 ， 20min 灭菌。灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。5灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。压力一定要降到“ 0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降， 使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧
12、瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染， 甚至灼伤操作者。6将取出的灭菌培养基， 需摆斜面的则摆成斜面， 然后放入 37温箱培养 24h，经检查若无杂菌生长，即可待用。五土壤微生物的分离1取土壤：取表层以下 510cm处的土样，放入无菌的袋中备用，或放在 4冰箱中暂存。2制备稀释液 ( 要无菌操作 )(1) 制备土壤悬液：称土样 0.5g ，迅速倒入带玻璃珠的 49.5mL 无菌水瓶中 ( 玻璃珠用量以充满瓶底力最好 ) ，振荡 510min，使土样充分打散，即成为 10-2 的土壤悬液。(2) 稀释：用无菌移液管吸 10-2 的土壤悬液 0.5mL，放入 4.5mL 无菌水中即为 10-
13、3 稀释液，如此重复，可依次制成10-3 10-8 的稀释液。注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换用一支移液管，每次吸入土液后，要将移液管插入液面，吹吸3 次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。六混菌法测定菌落数的方法(1) 细菌：取 10-7 、10-6 两管稀释液各 1mL，分别接人相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿。然后取冷却至 50的牛肉膏琼脂培养基，分别倒入以上培养皿中 ( 装量以铺满皿底高 1.5 2mm为宜 ) ，迅速轻轻摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成细菌平板。倒平板时要注意无菌操作。（2）放线菌：取 10-5 、10-4 两管稀释液，在每管中加入 10%酚液 56 滴，摇匀，静置片刻，然后分别从两管中吸出1mL加入相应标号的平皿中，选用高氏1 号培养基，用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成放线菌平板。（3）真菌：取 10-2 、10-3 两管稀释各 1mL，分别
