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1、绿色荧光蛋白（EGFP ）克隆并在大肠杆菌表达详细项目实施计划书生物技术1001 班 EGFP 基因完整的序列:ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGC
2、ACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACC
3、ACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATC ACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTA PCR 引物引物 序列（5-3）酶切位点 描述Pl GAC GGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGABamHI5 GFP geneP2GCC GAATTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATG EcoR I 3 GFP ge
4、ne601 pEGFP-NB3B 全图谱AflW 11636）Dra III（1870）BsrG I（1385）A/OZI （1398）co0109lpEGFP-N34.7 kb5S1GCTAGC GOT ACC 盼 CTC AGATCT CGA GOT CAA GCTTCG AATTCT GCA GTC GAD GGTACC GCGGGC COG GGATCCATC GCCACCATG GTG6112131B41G516G1EGFPMe I Econ IIIBgl I AJjoI , Hind III coR I Pst Sal I Kpn pa硼Xcm3 订严询SI实验使用的EGFP蛋白取
5、自原核-真核穿梭质粒pEGFP-NB3B的蛋白质编码序列。此质粒原本被设计于在原核系统中进行扩增，并可在真核哺乳动物细胞中进 行表达。本质粒主要包括位于PCMV真核启动子与SV40真核多聚腺苷酸尾部之 间的 EGFP 编码序列与位于 EGFP 上游的多克隆位点；一个由 SV40 早期启动子启 动的卡那霉素/新霉素抗性基因，以及上游的细菌启动子可启动在原核系统中的 复制与卡那抗性。在EGFP编码序列上下游，存在特异的Bam H I及EcoR I限制 性内切酶位点，可切下整段EGFP编码序列。pET-28a质粒全图谱ECC57 1(3772Sma 1(4300)AlwN 1(3640)BssS 1
6、(3397)Pvu 1(4426)Sgf 1(4426)Ola 1(4117) v iNru 1(4083)XhO 1(158)Not 1(1 S6) Eag I门附Hind 111(173)Sal 1(179)Sac 1(190)EcoR 1(192)BamH 1(198)” Nhe 1(231)/ Nde 1(233)NCO 1(296Xba 1(335) zBgl 11(401) 、.二 SgrA 1(442)L-Sphl 1(598)/MIU 1(1123) 卜 Bd 1(1137) BstE 11(1304；| ?-Apa 1(1334)hBssH 11(1534) /EGOR V(
7、1573)Hpa 1(1629)PshA 1(1968)BspLU1 1 1(3224)Sap 1(3100)Bst1107 IIC2995Tth111 1(2369)-Bgl 1(2167)Fsp 1(2205) Psp5 11(2230)T7 promoter primer #69348-3pET upstream primer #69214-3T7 promotera BglWklac operatorXba IAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACT
8、TTAAGAAGGAGANcoHis* TagNde I Nhe IT7*TagTATACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAMetGIySerSerHIsHIsHIsHIsHisHisSerSerGIyeVoJPoArqGJSerHisMetA IaSerMetThrGIyGIyGInGInE% thrombinpET-28a(+) BamH I EcoR I Sac I Sa/1 H/nd III N& XhoHisTagATGGGTCGCGGATCC
9、GAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCC MetGIyArgGIySerGIuPheGIuLeuArgArgGI nA IaCysGIyArgThrArgAIaProProProProProLeuArgSerGIyCysEnd.GGTCGGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCC pET-28b(+) .GIyArgAspProAsnS
10、erSerSerVaIAspLysLeuAIaAIaAIaLeuGIuHIsHIsHIsHIsHIsHIsEnd.GGTCGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCC pET-28c ( + ) .GlyA 厂 gl leA 广 gl 丨 eArgA 丨 oP 厂 oSe 厂 Thr*SerLeuArgP 厂 oH 丨 sSerSe 厂Th 厂ThrTh 厂 Th 厂 Th 厂ThrG I u I 丨 eAfgLeuLeuTh 厂 LysPro .Bpu1102
11、 I T7 terminatorGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCG?TGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGT7 terminator primer #69337-3表达EGFP蛋白使用的pET-28原核载体包含有在多克隆位点两侧的His-tag polyHis编码序列；用于表达蛋白的T7启动子，T7转录起始物以及 T7 终止子；选择性筛选使用的 lacI 编码序列及卡那霉素抗性序列， pBR322 启 动子，以及为产生单链 DNA 产物的 f1 启动子。 引物一材料1 实验材料克隆菌 E.c
12、oli DH-5a、表达菌 BL-21，质粒 pET-28a 和 pEGFP-N3，引物， 限制性内切酶Bam Hl、Not I。2 仪器设备电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套、pH计、 冰箱、台式冷冻恒温振荡器、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电 泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、移液枪、枪头 、接种环 、 酒精棉球、灭菌枪头、Parafilm膜、离心管。3 试剂及溶液50XTAE电泳缓冲母液（50 mL）Tris-碱12.1 g冰醋酸 2.85 mL0.5 mol/L EDTA （pH 8.0） 5 ml6XDNA电泳缓冲液溴酚蓝 0.25 %蔗
13、糖水溶液 40%（ W/V）液体 LB 培养基（ pH7.0）胰蛋白胨10 g/L酵母提取物 5 g/LNaCl 10 g/LNaOH(1 mol/L) 1 mL/L分装后于121 C高压灭菌20 min。(LB固体培养基是在液体LB中加琼脂粉至1 %)；溶液I 50 mL葡萄糖 50 mmol/LTris-Cl (pH 8.0)25 mmol/LEDTA (pH 8.0)10 mmol/L121C高压灭菌15 min后置于04C贮存；溶液II 100 mLNaOH 0.2 mol/LSDS 1% (W/V)用时由母液2 mol/L NaOH、10%(W/V) SDS稀释现配；溶液III 10
14、0 mLKOAc (5 mol/L) 60 mL冰乙酸 11.5 mLH2O 28.5 mL121 C高压灭菌15 min后置于04 C贮存；氯仿；琼脂糖；灭菌的去离子水；10 X酶切缓冲液；TaqDNA聚合酶；TaqDNA聚合酶缓冲液；灭菌的0.1 mol/L CaCl2标准相对分子质量的DNA；溴乙锭(EB)储存液0.5卩g/mL；LB/Kan （50卩g/mL）固体培养基;IPTG配成浓度为400 mM水溶液，-20 C保存备用；卡那霉素（Kan）配成浓度为100 ug/mL水溶液，-20 C保存备用；70%乙醇：用新开装的乙醇和灭菌无离子水配成，放在04 C； 无水乙醇（分析纯，武汉市
15、中天化工有限公司）放在04 C；RNase 母液：将 RNase 溶于 10 mmol/L TriCl（pH 7.5）、15 mmol/L NaCl 配 成的试剂中，配成10 mg/mL的溶液，在100 C加热15 min,使可能溶有的DNase 失活，然后缓慢冷却至室温，分装成小份保存于20 C；二方法1重组质粒的构建图1重组质粒pET-28a-GFP的构建流程2 DH-5 a和BL-21感受态细胞的制备1）将04 C保存的DH-5 a和BL-21菌种分别接种在LB液体培养基中37C下 250r/min过夜培养16h。2）将分别接种过夜菌：LB按1:50的比例接种于2 mL的LB液体培养基中，37C 活
