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1、涵草堂去黑头收缩毛孔官网：http:/信号通路在FSH促进卵巢癌细胞增殖与侵袭中的作用 卵巢癌发病机制的研究一直是妇科肿瘤学界关注的热点。近年来的研究表明,卵巢癌的发生和进展与其所处的激素环境有关:绝经、排卵多或不孕治疗时过量卵泡刺激素(FSH)刺激可能是卵巢癌发生的重要危险因素。多项研究显示,FSH通过作用于细胞表面H受体(HR)激活细胞内信号传导通路而发挥作用,但其具体作用机制尚不清楚:本研究主要探讨H是否通过磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路调节核因子B(NF-B)的活性,而促进卵巢癌细胞增殖和侵袭,为卵巢癌的发病机制和基因治疗提供实验依据。材料与方法 一、材料来
2、源 卵巢浆液性囊腺癌细胞株SKO为北京大学人民医院妇科实验室惠赠;卵巢黏液性囊腺癌细胞株3A0为河北医科大学第四医院实验中心惠赠。注射用重组人FSH为瑞士Laboratorc serrono SA公司产品;PI3抑制剂一LY294002购自美国P公司。兔抗人FSHR、Akt1/2抗体购自武汉博士德生物工程有限公司;兔抗人磷酸化Akt(pAkt)、NF-B p65抗体购自美国Santa Cruz公司;核蛋白抽提试剂盒购自上海捷瑞生物技术有限公司。 二、方法 I,细胞培养:SKO3、3A0细胞接种于含有10%胎牛血清、100U/llll青霉素、100U/ml链霉素的RPMH 1640培养基中,置于
3、37、饱和湿度、5%C02培养箱中培养,取对数生长期的SKO3、3A0细胞用于以下实验,实验分为4组,即对照组、H红】、LY294002组禾口FSH+LY294002组(LY294002处理30min后加入鸭H)。H组以佃U/L的FSH Qlx理SK0348h、3A0细期包24h;LY294002组以10umol/L的LY29硐02处理SKOVs细胞48h、3A0细胞24h;FSH+LY294oo2组以10umol/L的LY294002处理30min,再加入们U/L的FSH继续列3里SKO3细胞48h、3A0细胞24h。 2.四甲基偶氮唑蓝比色法检测不同浓度H处理不同时间后SKO、3A0细胞的
4、增殖情况:取对数生长期SKO3、3AO细胞,胰酶消化后,调整细胞密度为1105个/lnl,每孔100耐接种于%孔板,培养68h,待细胞贴壁后,换为含不同浓度(分别为10、20、40、80、I60U/L)FSH的RPMI1640培养基将SKO3、3AO细胞制成单细胞悬液,按1105/ml接种于96孔板,均设置5个复孔,置于37、饱和湿度、5%Co2培养箱中分别培养12、叨、48、72h,每孔加人四甲基偶氮唑蓝(MTT)液10l、磷酸盐缓冲液(PBS)l,继续培养4h,加入1OO10%十二烷基硫酸钠(SDs),继续孵育4h,置全自动酶标仪于570nm处测定各孔吸光度值,以不加细胞孔作为空白对照,0
5、U/L的H处理孔作为相应细胞的对照,计算细胞增殖率,细胞增殖率(%)=(AF-A空白瑚贾)/(A对照空白对照)1OO%。实验重复3次,取均值。3.倒置显微镜观察各组SKOVs、3A0细胞的形态:取对数生长期的SKO3、3AO细胞接种于放有盖玻片的培养皿中培养,按对照组、H组、LY294002组和H+294002组的相应方法处理,倒置显微镜观察各组细胞的形态。4.体外侵袭实验检测各组sKO3、3AO细胞的侵袭能力:用50mg/L人工基底膜基质凝胶(matrigel,按8稀释)包被穿膜(transwe11)小室底部膜的上室面,每孔100淤,37放置2h,置室温紫外线照射过夜千燥,风干的matri叩
6、1胶加37无血清培养基再水化。在预包被的tran洲e11小室中每孔加人细胞悬液0ul(含2104个细胞),下室加人RPMI1bZI0培养基500耐,37、5%C02培养箱培养,待细胞贴壁后,按各组的相应方法处理48h。擦去transWe11小室上面未穿过的细胞,风千后用0,1%结晶紫染色30min,镜下(100)计数10个不同视野中的穿膜细胞数。实验重复3次,取均值:5蛋白印迹法检测各组SKO3、3AO细胞中HR、Akt1”、pAkt、NF B蛋白的表达:PBS冲洗细胞2次,加入适量的蛋白裂解液,冰浴裂解30血n;412000min离心min,取上清液,考马斯亮蓝法测定蛋白浓度,分装后-70冻
7、存各用。采用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳分离蛋白,水浴式电转移装置将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上,5%脱脂奶粉封闭1h,一抗4孵育过夜,三羟基氨基甲烷-枸橼酸盐缓冲液(TTBS)洗膜后,加人辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔坨G二抗,37孵育1h,BS洗膜后化学发光法显色,暗盒中曝光:显影后将线片用数码相机照相后,用Image J图像分析系统对图像进行光密度扫描,各组均以目的蛋白条带的A值与内参照肌动蛋白(-犯tin)的A值的比值表示该日的蛋白的相对表达水平。实验重复3次,取均值。 三、统计学方法 应用SS130软件进行统计学处理。数据以冗s表示,各组均数的比较采用单因
8、素方差分析,两两比较采用最小显著差法(D)。结果 一、不同浓度FSH处理不同时间后SKO3、3AO细胞增殖率的比较SK03、3A0细胞经浓度分别为10、40、801U/L的H处理12、24、48和72h后,其细胞增殖率明显高于相应对照细胞(均为100%,P(0,05)。40IU/L自勺FSH处理sKo3细胞48h、3A0细胞zh时,其细胞增殖率最高。因此,本研究选用硐U/L的H处理SKO3细胞48h、3AO细胞zh作为条件进行以下实验。 二、各组sKO3、3A0细胞的形态 倒置显微镜观察,对照组SKO3、3AO细胞均呈单层贴壁生长,sK03细胞为短梭形、3AO细胞为梭形,胞核均呈圆形或椭圆形,
9、胞质透亮。H组梭形胞体均变长或呈多角形,形态饱满,部分区域出现叠加生长,胞核较前稍增大,密度明显大于对照组1D;LY294002组两种细胞体积普遍变小,胞质浓缩,部分细胞变圆漂浮,形态不规则,可见细胞碎片,贴壁细胞减少,见图1E、1F;H+LY294002组较H组密度小,形态较对照组无明显改变, 三、各组SKO、3、3A0细胞的侵袭能力 对照组、FSH组、LY294002组及FSH+LY294002组SKO3细胞的穿过细胞数分别为(266)、(11819)、(185)、(387);3A0细胞的穿过细胞数分别为(194)、(134)、(123)、(5811)个。H组两种细胞的穿过细胞数均明显多于
10、对照组(P0“);LY29硐02组及H+LY294002组两种细胞的穿膜细胞数均明显少于FsH组(P0.05)。 2.pAkt、NF-B蛋白的表达:(1)SKO3细胞:H组SKOlr3细胞中pAkt蛋白的表达水平明显高于对照组,而H+LY294002组明显低于H组,LY294002组明显低于H组和对照组,差异均有统计学意义(P0,0.05)。FSH组SK0V3细胞的胞核与胞质中NF-KB p65蛋白表达的比值明显高于对照组,喵H+L94002组明显低于FsH组,LY294002组明显低于H组和对照组,差异均有统计学意义(P(0.05)。(2)3A0细胞:与SK03细胞的实验结果相似,鹏H组3A
11、O细胞中pAkt蛋白的表达水平明显高于对照组,而H+L294002组明显低于FSH组,LY294002组明显低于H组和对照组,差异均有统计学意义(P0.05。FSH组3A0细胞的胞核与胞质中NR-KB p65蛋白表达的比值明显高于对照组,FSH+LY294002组明显低于姑H组,LY294002组明显低于FSH组和对照组,差异均有统计学意义(P0.05)。讨 论 一、FSH对卵巢癌SKO3、3AO细胞增殖和侵袭能力的影响 FSH是腺垂体分泌的一种糖蛋白激素,其结构和功能已被广泛研究。正常卵巢中,H可直接促进窦前卵泡和窦卵泡颗粒细胞的增殖分化,激活颗粒细胞芳香化酶合成和分泌雌二醇、抑制素A和激活
12、素等物质。H在卵巢癌发生、发展中的作用尚有争议。一些研究发现,H可促进卵巢癌细胞增殖和侵袭;也有作者认为,血循环中H浓度的升高与卵巢癌的发生无关。本研究发现,用10丬U/L的FbH处理SK03、3A0细胞1272h后均可促进这两种细胞的增殖(P0.05),当H浓度为绷U/L时,其细胞增殖率最高;同时,体外侵袭实验证明,娴U/L的FSH也可明显增强SKO3、3AO细胞的侵袭能力,这一浓度在绝经后妇女外周血FbH水平范围内,支持促性腺激素致癌的观点,然而,其作用机制仍有待探讨。二、PI3K/Akt/NF-B信号通路介导的FSH对SK03、3AO细胞的作用PI3是脂质激酶家族的成员,可调控细胞代谢、
13、生存和增殖。Akt是信号传导通路中重要的蛋白激酶,是PI3K下游的靶蛋白,pAkt是Akt磷酸化后的活性形式,它与肿瘤的发生、发展密切相关。NF-B是Akt重要的下游分子之一,其异常活化可调节与细胞增殖和凋亡有关的基因转录,溶解细胞外间质,促进肿瘤细胞的浸润和转移。FSH能否通过PI3AkNF-KB信号通路影响卵巢癌的发生、发展,则有待进一步研究。本研究中,蛋白印迹法检测显示,H处理卵巢癌细胞SK03、3A0后,细胞内pAlct蛋白表达增加,NF-KB胞核与胞质比值也发生同向变化,而PI3抑制剂LY294002则能逆转H的作用。推测,H可能通过与细胞膜上的HR结合,并转位至胞质激活PI3,进而
14、使Akt通过磷酸化的方式被激活,PI3Akt信号通路异常活化,促使核因子转录囚子抑制因子的降解,从而使NF-KB从复合物中解离并定位到细胞核中,产生转录活性,促进细胞增殖和侵袭;而LY29硐02可逆转喵H的作用,抑制PI3Akt信号通路的异常活化,从而抑制NF-B的核移位,进而降低卵巢癌细胞的增殖和侵袭能力。 综上,本研究以卵巢癌细胞株SKO3、3A0细胞为研究对象,发现FsH可通过PI3/Akt信号通路上调NF-B的活性,增强卵巢癌细胞的增殖和侵袭能力。提示,卵巢癌的发生可能与H有关,控制体内H浓度,可能会降低卵巢癌的发生率,减缓其恶性进程,降低卵巢癌术后残留病灶的复发率;并且PI3K/Akt和NF-B可能成为卵巢癌基因治疗的重要优选靶点,有望成为卵巢癌的有效化疗药物。专业介绍中医知识：涵草堂雀斑官网http:/
