《饲喂抗生素对猪肠道内微生物群系的影响.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《饲喂抗生素对猪肠道内微生物群系的影响.doc（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、In-feed antibiotic effects on the swineintestinal microbiome饲喂抗生素对猪肠道内微生物群系的影响周勇（译）摘要：抗生素在农业型动物上的使用已有超过50年的历史，其有助于对动物疾病治疗、疾病预防以及促进其生长。然而这类抗生素的应用对人类疾病治疗的影响是一个激烈争论的话题。本实验在高度控制的环境条件下对猪进行饲养试验，同一窝猪仔选择一部分饲喂含有高性能抗生素（金霉素、磺胺甲嘧啶和青霉素，被称为asp250）的饲料，另一部分用不添加抗生素的相同的饲料饲喂。我们采用系统发育学，基因组分析，以及定量PCR的方法，来处理抗生素对猪肠道微生物的影响
2、结果。14天后添加抗生素处理的菌群类型发生转变，饲喂药物的猪肠道内的有益菌的数量比不含药物的增加（1-11%）。这种转变是由于大肠杆菌的数量增加。宏基因组的分析表明，在饲喂抗生素的猪体内，微生物所含有的与能量产生和转化有关的功能基因增加。探究结果还表明，没有饲喂药物的猪内也具有较高的抗生素抗性基因，但饲喂药物的猪体内抗生素抗性基因的丰富性和多样性都增加。一些丰富的基因如氨基糖苷类的O磷酸基转移酶对试验中没有使用的抗生素也产生抗性。这表明，其对没有被饲喂的抗生素有间接选择的潜力。抗生素亚治疗剂量饲喂的副作用是明显的，并且必须考虑对成本效益分析。关键词：肠道菌群，微生物组转化，猪肠道内细菌，Bio
3、 Trove芯片，基因组分析。 在传统的农业饲养技术中，抗生素是维持或改善动物健康和饲料转化率的最具成本效益的一种方式。除了提高饲料的转化率外，抗生素也普遍用于牲畜、家禽以及鱼类的疾病治疗和预防。据报道，农业使用的抗生素总量占据美国各类抗生素生产总量的一半。尽管抗生素的使用对农业的作用非常明显，但是抗生素的滥用以及动物和人类病原菌对多种抗生素的抵抗性的迅速、普遍的出现，已经使人类对当前抗生素的使用产生质疑。对环境和肠道微生物群落的研究揭示了抗生素抗性基因的丰富多样性。添加抗生素进行饲喂，提供了一种选择压力，这可能导致牲畜体内共生的生物群落产生持续的变化。此外，抗生素抗性基因的存在已被证明在细菌
4、群落中是稳定的，即使在没有抗生素的情况下也存在。对抗生素抗性基因丰富性增加的主要担心是抗性基因向病原体中的转化。因此，食品和药物管理局最近发布了一份草案，建议限制抗生素在畜牧业的使用。而美国社会传染病监测机构早在国会委员会通过之前就支持这种限制。 动物肠道内定居的细菌对维持宿主的健康有重要作用。肠道微生物有助于宿主对营养物质的吸收，增强宿主免疫系统并促进肠道上皮细胞的形成，是一个抵抗病原体的天然防御系统。 然而和这些好处相反，肠道菌群有可能通过远缘生物进行抗性基因的扩散，对将来的治疗产生抗性。例如，人类结肠癌细胞中的共生细菌藏有抗生素抗性基因，且能够将这些基因转移给病原体。事实上，水平基因转移
5、在很大程度上是由革兰氏阴性菌的多重耐药性引起的。随着对人类食物链中所含共生菌中的抗生素抗性基因的确定，作为动物和食源性致病菌的抗性基因储存者的肠道微生物，其作用需要进一步探索研究。 通过培养和PCR方法对狭窄组的细菌或基因组进行研究，已经获得了一些有价值的见解，如猪体内分离的红霉素抗性基因；然而，每日饲喂压剂量的抗生素对牲畜体内的微生物的综合作用还没有研究。因此，我们试图对饲喂抗生素对整个肠道内微生物群系的影响进行一个广泛性的评估。 采用种群类型分析、宏基因组学和平行定量PCR追踪微生物菌株间和编码功能的变化，有利于对所谓的抗生素的副作用效果的检测（也就是促进生长和预防疾病之外的其他效果）。这
6、些负效应包括大肠杆菌的数量增加和抗生素抗性基因丰度的增加。 仔猪在艾姆斯IA国家动物防疫中心出生，并在高度控制和净化的室内饲养，避免加药动物、非加药动物和栏里面的其他动物发生药物之间的交叉污染。无论仔猪还是母猪实验之前都没有接触抗生素。这种设计是为了确保从母体获得同水平的仔猪，最大限度的减少变异，使抗生素治疗的效果能够被检测。在18周龄时，同窝猪仔的一组饲喂ASP250饲料（含有药物），另一组饲喂未修饰的饲料（不含药物），饲喂3周。ASP250是一种抗生素类的饲料添加剂，含有金霉素、磺胺、青霉素，通常用于猪细菌性肠炎的治疗和提高饲料转化效率。采集处理前0天和处理后3，14和21天的粪便样本。0
7、天样本用来描述抗生素治疗以前的猪肠道内微生物群系。结论： 饲喂ASP250的微生物区系成员的转变。从12份粪便样品中，分离16S rRNA基因中V3区的133，294序列。对相同处理和取样日期相同的猪的数据进行分组，评价抗生素对群系微生物成员的作用效果。据哺乳动物肠道环境的报道和最新的宏基因组学研究，大部分可分类的序列，属于拟杆菌、厚壁菌以及变形菌群（如表S1）。拟杆菌中的普雷沃菌属一贯丰富，作为猪体内微生物组特征的展现。用布雷斯柯蒂斯指数对所有样品进行组合计算和相似性分析。对这些数据进行非度量多维尺度（NMDS）的绘图表明饲喂14天的样本与0天的样本 (P0.01)发生偏离，且掺入药物处理的
8、微生物组与未添加药物的背离而驰（如图1A），表明微生物群落成员随着时间的推移，在治疗作用下的变化。 与ASP250处理有关的微生物群落的具体变化包括拟杆菌丰富度的减少，以及厌氧杆菌属，Barnesiella ， 乳头菌属 ，sporacetigenium 和八叠球菌属等的一起减少。在ASP250处理作用下，异常球菌-栖热菌和变形杆菌类以及琥珀酸弧菌属和瘤胃球菌属的成员增加（如表S1）。在饲喂ASP250中变形菌丰度的增加最为显著：不含药物饲喂的动物体内数量为1%，用抗生素处理的数量为11%（如图1B）。具体的来说，大肠杆菌群是饲喂药物和不饲喂药物动物的主要区别，饲喂药物的动物体内包含有62%的
9、变形杆菌（如图1C）。通过宏基因组数据（如图1D）和针对大肠杆菌uidA基因的定量PCR证实了大肠杆菌数量的增加（P0.05）。用12头猪采用相似的处理进行另一项研究，通过养殖技术进一步分析确立，饲喂ASP250的猪，在处理14天后大肠杆菌数量增加，与未添加药物饲喂的猪相比，大肠杆菌丰度增加20到100倍（如图S1）。 使用ASP250功能基因丰度的变化。分别从不含药物饲喂和含药物饲喂猪0天和14天的粪便中分离DNA样本，按处理方式和日期结合对样本进行焦磷酸测序。利用MG - RAST种子子系统进行宏基因组序列分析，并在内部同源体中集群。通过COG和子系统分析，所有的宏基因组数据表明：随着时间
10、的推移，功能稳定（如图S2）。最丰富的SEED子系统的功能是碳水化合物的新陈代谢，先前报道的有关猪的宏基因组的镜像。一个COGS统计分析显示，使用ASP250饲喂后在微生物区系中的功能变化：饲喂药物的样本中的微生物含有169 COGS,明显比不饲喂药物的宏基因组丰富（如表S2）。三个COGS（0477，主要为促进性超家族的透性酶；1289，预测膜蛋白；3670，链霉素6-激酶）包含有猪的宏基因组基因，这类基因在抗生素抗性基因库中（ARDB）被标注为抗性基因。COGS中具有最低P值的三个（3188,3539,3121），含有与P菌毛装配有关的基因，此外，在统计学上重要的COGS是转座酶（0675
11、,1662,4644)。 确定饲喂药物与不饲喂药物的宏基因组之间COGs的不同表现的主题，表S2中的COGs按照各自的COG类别进行聚合。只有一个COG的功能类别、能量产物和转换（C）在加药的宏基因组中比在不加药的宏基因组中更加频繁（P0.05）（如表S3）。 在缺乏抗生素暴露的条件下普遍的耐药性。使用抗生素处理引起的COGs的相关抗性的波动，这一发现引起对宏基因组的进一步研究，通过BLAST对ARDB方法进行。不管抗生素处理，所有的宏基因组藏有序列的相似性在各种耐药性基因的表达和大多数耐药机制中：外排泵、抗生素修饰酶以及抗生素目标的修饰或保护（如图2A）。在0天的宏基因组中分析检测149个不
12、同的抗性基因。图1、使用抗生素处理的粪便中微生物群系成员的改变。（A、）Bray-Curtis 相似性系数的NMDS分析，该相似性系数由来自于处理0天和14天动物个体中获得的16S rRNA数据推算出来，分析显示了猪粪便样本复制之间的相似性。（B、）粪便微生物群落中门水平的组成成分。按给定的处理和采样时间点合成数据，表示丰度的百分比。（C、）样本中所含变形杆菌门属的成分，由序列总数表示（总数正常值为50，000）。（D、）基于BLASTx分析，在猪的宏基因组中发现了COG3188的预测基因。在添加药物的宏基因组中COG3188与没有添加的相比过度表达。在没有饲喂药物的宏基因组中，粪便中抗生素抗
13、性基因的多样性的发现得到了平行定量PCR分析的支持。采用qPCR，在猪的粪便样品中，至少一次检测到了57抗性基因的丰富条带序列。从不饲喂药物的动物取得的样品显示共有50种不同的耐药性基因，但这些基因很少在动物间共享：检测66%的样品，只有五个 ermA, ermB, mefA, tet(32), and aadA被检测，在多于80%的样品中没有检测到。在饲喂药物的动物中没有检测到这些基因的富集，即使核酸的保护蛋白tet（32）也没有被检测到，这种物质被授予为抗管理抗生素（四环素）。饲喂药物的动物产生的样品有更强的同质抗性基因多样性：38个基因至少在一个药物处理的样品中检测到，在66%的样品中检
14、测到了19，有10个mefA, ermA, ermB, tet(32), te(O), aadA, aph(3)-ib, bcr, acrA, and bacA在至少九分之八的样品中被检测到。 定量PCR和宏基因组分析揭示了药物处理猪中耐药性基因的丰富性和丰度的变化。ARDB的统计分析结果表明，23个基因在药物处理和非药物处理的宏基因组中进行不同的表达（如表1）。20个基因在药物处理的宏基因组中丰度更大，可协助外排、磺胺类抗性以及氨基糖苷类抗性，其中后者对一类抗生素所表达的抗性在ASP250中不表达（如表1）。 qPCR的结果反应了宏基因组的分析，揭示了在统计分析显著下六个抗性基因类型载药物处
15、理的宏基因组中比在非药物处理的宏基因组中的丰度更大（p0.05）。误差线代表SEM。(C) 依据对耐药性基因丰度的qPCR的数据计算Bray-Curtis相似性系数 并绘制多维尺度图。点与点之间的距离，表明样品间抗性基因的多样性的差异程度。样本离群值（方形）来自于第21天药物处理猪。0天样品的测量不显示。Table 1. 处理期间，用宏基因组每个耐药基因在宏基因组中的序列号：药物处理（n=1）VS 非药物处理（n=3）和qPCR基因拷贝数/16S rRNA的基因拷贝数检测药物处理和非药物处理的猪的粪便样本中耐药性基因的差异描述(P 0.05)。 通过qPCR检测ASP250处理增加了抗性基因类型的多样性香浓指数1.4（药物处理），0.8（无药物处理)，P=
