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1、ELISA步骤、试剂及注意事项操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法：1 .包被：用o.05MPH9.油碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1-10以g/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml,4c过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。2 .加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37c孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。3 .加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1mL37c孵育0.57小时，洗涤。4 .加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物
2、溶液0.1ml,37c底溶分钟。5 .终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05mlo6 .结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“ +”号表示。也可测0 D值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔0D值，若大于规定的阴性对照0D值的2.1倍,即为阳性。方法二用于检测未知抗体的间接法：用包被缓冲液将已知抗原稀释至1-10四/ml,每孔加0.1ml,4c过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37c孵育1小
3、时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml,37c孵育30-60分钟，洗涤，最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、60试剂器材1 .试齐1J(1) 包被缓冲液(PH9.60.05M碳酸盐缓冲液):NaC03?1.59克NaHC032.93克加蒸储水至1000ml(2) 洗涤缓冲液(PH7.4PBS):0.15MKH2P040.2克Na2HP0412H202.9克NaCI8.0克KCI0.2克Tween-200.05%0.5ml加蒸储水至1000mI(3)稀释液：牛血清白蛋白(BSA)0.1克加洗涤缓冲液至100ml或
4、以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5s10%使用。(4)终止液(2MH2S04):蒸播水178.3ml,逐滴加入浓硫酸(98%)21.7ml(5) 底物缓冲液(PH5.0磷酸JK柠檬酸):0.2MNa2HP04(28.4克/L)25.7ml0.1M柠檬酸(19.2克/L)24.3mI加蒸储水50ml。(6) TMB(四甲基联苯胺)使用液：TMB(10mg/5ml无水乙醇)0.5ml底物缓冲液(PH5.5)10ml0.75%H20232出(7) ABTS使用液:ABTS0.5mg底物缓冲液(PH5.5)1ml3%H2022以I(8)抗原、抗体和酶标记抗体。(9)正常人血清和阳性对照血清。2 .器
5、材：(1)聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔，ELISA检测仪，50出及100以I加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。(2)小烧杯、玻璃棒试管、吸管和量筒等。3 3)4c冰箱，37c孵育箱。注意事项1 .正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件,待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭2 .在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括：（1）固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。具形式可以是凹孔平板试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不
6、管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。（2）包被抗体（或抗原）的选择：将抗体（或抗原）吸附相载体表面时，要求纯度要好，吸附时一般要求PH在9.09.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响，一般多采用4c18s24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度（0.1、1.0和10的/ml等）进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的0D值。选择0D值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为10四/ml。（3）酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定（见酶标记抗体部份）。然后再固定其它条件或采取“方阵法（包被物待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度）在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。（4）酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体（如OPD等）有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H202在临用前加入。
