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1、酵母穿梭质粒的构建的初稿一、 实验目的1. 学习构建穿梭质粒的原理2. 掌握构建人工质粒的方法二、实验原理所谓穿梭质粒是指是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可在两种不同的寄主细胞存活和复制的质粒载体。此概念不仅用于不同的微生物菌群之间，也可以推广到真核生物表达载体的构建，如用于枯草的pBE2、酵母的pPIC9K、哺乳动物表达载体pMT2 和用于植物细胞的Ti质粒。这些穿梭质粒不仅可以在大肠杆菌中复制扩增，也可以在相应的枯草、酵母、动物或植物细胞中扩增和表达。这样利于对质粒的分子生物学操作和大量制备。本实验采用的是大肠杆菌的pBR322和酵母菌的ARS403来构建穿梭质粒，
2、使其既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母菌种表达复制。ARS (autonomously replicating sequence自主复制序列)是染色体自主复制序列,是从酵母中克隆的真核细胞DNA复制起点序列。酵母每条染色体由多个复制子组成,复制子平均长度为36kb。整个基因组约由400多个复制子组成。ARS403是酵母第四号染色体上的第三个自主复制序列，通过提取酵母基因组DNA，设计合适的引物并加以酶切位点进行PCR即可得到ARS403，再以相同的限制性内切酶进行双酶切质粒和所得到的ARS403，进行酶连和重组子的筛选以及鉴定即可得到我们想要的穿梭质粒。三、 仪器、材料和试剂1、仪器：微量移液器
3、、Eppendorf管、台式高速离心机、常用玻璃仪器、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、恒温摇床、超净工作台、大肠杆菌DH5、2、材料：含有pBR322的大肠杆菌，大肠杆菌DH5，酵母菌3、试剂：（1）质粒提取试剂（2）酵母菌基因组提取试剂：SCED(1mol/L 山梨醇、10mmol/L 柠檬酸钠、10mmol/L EDTA、10mmol/L DTT二硫苏糖醇)溶菌酶2%SDS5mol/L KAc(pH 8.9)乙醇饱和酚和氯仿RNase (10mg/ml)TE(10mmol/L Tris-HCl，pH7.4，1mmol/L EDTA，pH8.0)7.5mol/L NH4Ac(pH7.5)（3）
4、PCR体系（4）酶切试剂（5）酶连试剂其他的自己看着写 四、 操作步骤（一） 质粒DNA的提取1、 培养细菌:将带有质粒pBR322的大肠杆菌单菌落接种到LB液体培养基中，37震荡培养8-16h2、 去液体培养基1.5mL于Eppendorf管中，转速10000rpm/min离心5min，去掉上清液，加入预冷的150L GET溶液，用枪头充分混匀后，放到冰上；3、 加入300L新配置的变性液，轻柔混匀4-5次，冰上放置5min；4、 加入150L冰冷的醋酸钾溶液（pH4.8），颠倒数次混匀后，冰上放置不超过5min；5、 用台式高速离心机，10000rpm/min离心10min，将上清液（约6
5、00L）移入另一干净离心管，并加等体积异丙醇混匀，室温放置5min后，12000rpm/min离心5min；弃去上清液6、 沉淀用1ml 70%乙醇清洗一次，离心管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥；7、 加入20L含有RNase20L/mL的TE缓冲液或灭菌蒸馏水溶解提取物，室温放置30min以上，是DNA充分溶解。（二） 酵母基因组DNA的提取1、 接种酵母培养基中(YPD培养基)，摇床培养30，培养1618h；2、 取1.5ml 酵母培养液，室温下，12000rpm，离心8min，收集菌体；菌体用灭菌水洗1次，12000rpm，离心5min；3、 弃上清，菌体用200l SCED(1
6、mol/L 山梨醇、10mmol/L 柠檬酸钠、10mmol/L EDTA、10mmol/L DTT二硫苏糖醇)溶液重悬，加入 30l 10mg/ml 溶菌酶37温浴1h；4、 加入100l 2%SDS混匀，20冰冻，然后室温震荡溶解，反复 3 次；5、 向悬浮液中加入150 l 5mol/L KAc(pH 8.9)轻轻混匀， 然后10000r/min离心5min；6、 将上清转移到一新的1.5ml 离心管中，加入2倍体积的乙醇，轻轻混匀，室温放置5min后12000r/min离心10min；7、 除去上清，将沉淀溶解在300l TE(10mmol/L Tris-HCl，pH7.4，1mmol
7、/L EDTA，pH8.0) 中，加入6l RNase (10mg/ml)，37温浴30min；8、 加入饱和酚和氯仿各150l 充分混匀，然后10000r/min离心5min；9、 转移上清到新的1.5ml 离心管中， 加入1/2体积的7.5mol/L NH4Ac(pH7.5)和等体积的异丙醇， 20放置20min后12000r/min 离心10min；10、 除去上清，加入300l 70%乙醇漂洗沉淀一次，10000r/min 离心5min；风干除去乙醇，用20l TE 溶解酵母DNA。（三） ARS序列的获得按照预先设计的引物对所提取的酵母基因组进行扩增1、 在0.5ml Eppendo
8、rf管内配制25L反应体系： 反应物 体积/L ddH2O 11.7510PCR缓冲液 2.52.5mmol/L dNTP 2.025mmol/L MgCl2 1.5引物1 1.0引物2 1.0模板DNA 5Taq酶 0.25混匀2、 按下述程序进行扩增94预变性 5min94变性 1min56退火 1min72延伸 1min重复步骤- 30次72延伸 10min3、 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析PCR结果配制10%的聚丙烯酰胺凝胶，取10L扩增产物电泳。在110V电压下电泳。电泳结束后，用EB染色15min，紫外灯下观察结果，若扩增出条带差为250bp左右即可用来构建穿梭质粒。（四） 质粒载体与A
9、RS序列的双酶切将步骤（一）和步骤（三）得到的质粒DNA以及ARS用于酶切，按下表分别加入所需试剂质粒 样品 酶解缓冲液 酶液质粒pBR322 10L 2L 2LARS403 10L 2L 2L加样后小心混匀，置于37水浴中酶解半小时，然后向管中加入上样液4L后进行电泳分析（五） 感受态细胞的制备1、从大肠杆菌DH5平板上挑取一个单菌落接于2ml LB液体培养基的试管中，37振荡培养过夜。2、取1ml 菌液转接到一个含有50ml LB的液体培养基的锥形瓶中，37振荡培养12小时。（此时，OD0.40.5，细胞数务必108ml，此为实验成功的关键）3、将菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10m
10、in。4、离心10min（4000rmin），回收细胞。5、倒出培养液，将管倒置1min以便培养液流尽。6、用冰冷的0.1molLCaCl2 10ml悬浮沉淀，立即放在冰上保温30分钟。7、04 4000rmin，离心10min，回收细胞。8、用冰冷的0.1molL CaCl2 2ml悬浮细胞（务必放在冰上）。9、分装细胞，每200L 一份。此细胞为感受态细胞。（六）大肠杆菌感受态细胞转化取200L 新鲜配制的感受态细胞，加入DNA 2L (50ng)混匀，冰上放置30min。同时做两个对照管。受体菌对照：200L感受态细胞+2L无菌水。质粒对照：200L 0.1molLCaCl2 溶液+2L
11、质粒DNA溶液。1、将管放到42C循环水浴12分钟。2、冰浴2min。3、每管加800LB液体培养基，37培养1h.(七)1、将适当体积（100L）已转化的感受态细胞，为转化的感受态细胞对照和质粒对照分别涂在含有氨苄青霉素（100g/ml）的LB培养皿中。再将感受态细胞分别涂布于LB培养基上，2、倒置平皿37培养1216小时，出现菌落。3、挑取质粒对照组和重组子的单菌落进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，进行对照。五、结果分析ARS403 Length: 247 Wed Jun 22 07:01:43 2011 Type: N Check: 7463 . 1 CCTTTATATG CCCATCTTGT ATAAGGTAGT TTTAAATTCT AAGTTATTCA 51 ATACTACTGA CTAATCATTG TTAATAGCAA TTTCGCAGTC ATGTTGGGCT101 CAAAATACTA TAGTCATTTT TGTGATTTTT TTTTTTTATT ATTTTGATTG151 AAGAAGGAAC AATTCGAAAT ATGGAGAAAA CGTAAAAAAT GTTAGAGTTA201 TAATCGAAAT TATCCTAGTT CAGATACTGA AACTTAGGCA TAGGTGT引物
